Die Autoren danken Dr. Schütze für seine Hilfe bei der Einrichtung der vorgestellten Methode und Dr. Zoller für den wertvollen Input in Bezug auf die korrekte Kalibrierung-Palette. Die Autoren erkennen auch das technische Personal der Massenspektrometrie Anlage.

Hinweis: Es wird empfohlen, in einer Dampfhaube zu arbeiten, beim Umgang mit organischen Lösungsmitteln wie Methanol. Alle Puffer und mobilen Phasen in volumetrischen Fläschchen vorzubereiten. Wenn nicht anders angegeben, können die Lösungen für bis zu 1 Monat nach der Zubereitung bei Zimmertemperatur gespeichert werden.
1. Vorbereitung der Kalibratoren und Qualitätskontrolle Proben
Hinweis: Eine entsprechende Analyse-Datenblatt für die Zubereitung von Lager und Spike-Lösungen ist die Zusätzliche Dateientnehmen. Fügen Sie aus Gründen der Rückverfolgbarkeit Hersteller, Katalog-Nummer und eine Losnummer jedes Antibiotikum in den entsprechenden Spalten ein. Lösen Sie alle Antibiotika im Kühlraum bei 4 ° C und halten Sie die Arbeitszeit so kurz wie möglich zu.
<ol><li>100 mL 25 % Methanol in Wasser vorbereiten: Vorausfüllen eine Volumetrische 100 mL-Flasche mit 25 mL absolute Methanol und bis zu 100 mL mit destilliertem Wasser füllen.</li>
	<li>10 mL 200 mM Essigsäure in Wasser vorbereiten: Vorausfüllen eine Volumetrische 10 mL-Fläschchen mit 9 mL HPLC Grade Wasser, 115 µL Eisessig (99,5 % Reinheit, 17,4 M) hinzufügen und fügen Sie destilliertes Wasser bis zu 10 mL.</li>
	<li>25 mL 25 % Methanol in Wasser mit 20 mM Essigsäure vorbereiten: Vorausfüllen eine Volumetrische 25 mL-Fläschchen mit 2,5 mL der wässrigen 200 mM-Essigsäure-Lösung, 6,25 mL absolute Methanol hinzugeben und die Flasche 25 ml mit destilliertem Wasser auffüllen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Präzisionswaage, um die richtigen Mengen an Antibiotika in 15 mL konische Röhrchen zu wiegen, wie beschrieben in die Zusätzliche Datei in der Spalte Ausgangsgewicht.</li>
	<li>Bereiten Sie Stammlösungen der Fluorchinolone Ciprofloxacin und Moxifloxacin in 25 % Methanol-Wasser einschließlich 20 mM Essigsäure. Um dies zu tun, fügen Sie das entsprechende Volumen die gewichteten Mengen wie in die Zusätzliche Datei in der Spalte "letzte Band" beschrieben hinzu. Schnell lösen sich die Fluorchinolon-Antibiotika in einem Ultraschallbad für 2 min und durch intensive aufschütteln.</li>
	<li>Stammlösungen Hemmhof, Meropenem, Linezolid und Piperacillin in 25 % Methanol-Wasser vorzubereiten. Um dies zu tun, die gewichteten Mengen fügen Sie das entsprechende Volumen hinzu, wie in der Ergänzenden Datei in der Spalte Endvolumen beschrieben und lösen Sie schnell der Antibiotika durch intensive aufschütteln auf. Meropenem wie der letzte Stoff auflösen.</li>
	<li>Kombinieren Sie die Stammlösungen aller Antibiotika, wie beschrieben in das entsprechende Volumen der Stammlösung Diagramm in die Zusätzliche Datei um das Zehnfache konzentrierten Spike-Lösungen liefern.</li>
	<li>Neun Bände der drogenfreien Serum mit einem Volumen von verzehnfacht konzentrierte Spike-Lösungen zu den Serum-Kalibratoren 0 – 7 Spike und Qualität kontrolliert (QC) A – D. Zum Beispiel 4,5 mL Serum in einem 10-mL-Polypropylen-Rohr 0,5 mL Spike-Lösung hinzu und 15 min im Kühlraum bei 4 ° C auf einem Roller-Mixer bei 50 u/min inkubieren.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sich wiederholende Pipette 100 µL-Aliquots der Kalibratoren und QCs in 1,5 mL Polypropylenröhrchen zu generieren.</li>
	<li>Die Kalibratoren, Qualitätskontrollen und antibiotische Stammlösungen bei-80 ° C bis zu sechs Monate lang zu speichern.</li>
	<li>Bereiten Sie für jedes Antibiotikum auch eine saubere Lösung mit 1.000 mg/L ein einziges Antibiotikum. Verdünnen Sie die entsprechenden Stammlösung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel (z.B.für Ciprofloxacin, mit 25 % Methanol-Wasser einschließlich 20 mM-Essigsäure). Hinweis: Die ordentlichen antibiotischen Lösungen sind erforderlich für das Instrument Stimmen nur.</li>
</ol>2. Vorbereitung des internen Standards-Mix
Hinweis: Interne Standards sind Isotopen-Label Gegenstücke der Analyten von Interesse, die eine Probe während der Probe Bereinigung hinzugefügt werden. Wie die internen Standards fast identische insgesamt physikalisch-chemischen Eigenschaften unbeschriftete Pendants haben, kompensieren sie die Matrix-Effekte einer bestimmten Probe.
<ol><li>Bereiten Sie 10 mL 50 % Methanol in Wasser durch Zugabe von 5 mL absolute Methanol, ein 10 mL-Fläschchen schütteln und füllen Sie bis zu 10 mL mit destilliertem Wasser.</li>
	<li>Bereiten Sie 10 mL 50 % Methanol in Wasser einschließlich 20 mM Essigsäure vor. Um dies zu tun, eine 10 mL Flasche 1 mL Essigsäure 200 mM hinzu, fügen Sie 5 mL absolute Methanol, und füllen Sie bis zu 10 mL mit destilliertem Wasser.</li>
	<li>Generieren Sie Stammlösungen von internen Standards (IS) mit 1.000 mg/L direkt in die Fläschchen des Herstellers. Lösen Sie Hemmhof -13C12D3 Sulfat in destilliertem Wasser, Meropenem-D6, Linezolid-D3und Piperacillin-D5 in einer 50 % Methanol-Wasser-Lösung. Ciprofloxacin-D8 in 50 % Methanol-Wasser mit 20 mM Acetat und Moxifloxacin Hydrochlorid -13C1D3 in destilliertem Wasser mit 20 mM Acetat auflösen.</li>
	<li>Kombinieren Sie die IS Stammlösungen in einem 1,5 mL Polypropylen-Rohr um eine fünffache konzentrierten internen standard Mischung zu erzielen. Fügen Sie 10 µL Hemmhof -13C12D3, 10 µL von Meropenem-D6, 1 µL von Ciprofloxacin-D8, 2 µL von Moxifloxacin-Hydrochlorid -13C1D3, 2 µL Linezolid-D 3, und 10 µL Piperacillin-D5 bis 965 µL 25 % Methanol-Wasser.</li>
	<li>Speichern der interne standard Stammlösungen und die fünffache konzentrierte IS Mischung bei-80 ° C.</li>
</ol>(3) Patientenprobe Lagerung
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass das Serum so schnell wie möglich erreicht wird und dass die Kühlkette von gefrorenen Proben erhalten bleibt.
<ol><li>Sammeln Sie das ganze Blut in das Serum Röhrchen.</li>
	<li>Lassen Sie das Blutgerinnsel für 20-30 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Trennen Sie das Serum aus dem Blut durch Zentrifugation bei 2.000 X g für 10 min.</li>
	<li>Übertragen Sie den überstand auf ein sauberes Polypropylen Rohr.</li>
	<li>Bis es untersucht, ist speichern Sie das Serum bis zu sechs Monate bei-80 ° C. Alternativ können speichern Sie die Proben bis zu 3 Tage bei-20 ° c</li>
</ol>(4) Puffer-Vorbereitung für die Chromatographie
<ol><li>Zur Vorbereitung 1 M Ammonium-Formiat im Wasser lösen Sie 6,306 g von Ammonium-Formiat in 100 mL HPLC Grade Wasser über ein 100 mL-Fläschchen schütteln auf. Die Lösung bis zu 1 Monat bei 4 ° c zu speichern</li>
	<li>Bereiten Sie die Mobile phase [10 mM Ammonium-Formiat im Wasser-Ameisensäure (99.9:0.1 V/V)]. Vorausfüllen Sie eine Volumetrische 1.000 mL-Flasche mit ca. 500 mL HPLC Grade Wasser, fügen Sie 1 mL Ameisensäure und 10 mL der Lösung 1 M Ammonium-Formiat und bis 1.000 mL mit HPLC Grade Wasser füllen. Übertragen Sie mobile Phase A zu, um eine saubere Glasflasche und verbinden Sie es mit der HPLC-Anlage. Lagern Sie die mobile Phase ein bis zu 2 Wochen bei Zimmertemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie die mobile Phase B. Transfer HPLC-Klasse absolute Methanol in eine saubere Flasche und verbinden Sie es mit der HPLC-Anlage.</li>
	<li>Absolute Methanol zu verwenden, da die Nadel Lösungsmittel waschen und schließen Sie die entsprechenden Schlauch an die Glasflasche mit mobilen Phase B.</li>
	<li>Generieren Sie die Dichtung und eine Säuberung das Lösungsmittel Methanol-Wasser-Ameisensäure (7:92.9:0.1, V/V/V). Vorausfüllen Sie eine Volumetrische 1.000 mL-Flasche mit ca. 500 mL destilliertem Wasser, fügen Sie 70 mL absolute Methanol, Ameisensäure, 1 mL und 1.000 mL fügen Sie destilliertem Wasser hinzu. Übertragen Sie das Lösungsmittel auf eine saubere Glasflasche und verbinden Sie es mit der HPLC-Anlage. Hinweis: Verschiedene Autosampler Systeme verwenden eine starke und eine schwache Nadel Waschlösung. Bereiten Sie in einem solchen Fall die Waschlösungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Zum Beispiel Waschen der starken waschen mit Alkohol Methanol-Wasser-Isopropylic (70:20:10, V/V/V) und die schwachen mit Wasser-Methanol (95:5, V/V).</li>
</ol>(5) Instrument Tuning
Hinweis: Dieser Schritt ist für den Aufbau der Methode auf einen bestimmten Massen-Spektrometer durchgeführt.
<ol><li>Verdünnen Sie ordentlich 1.000 mg/L Analyten und der interne standard-Lösungen 01:10 oder 1: 100 in einer Mischung aus mobilen Phase A und B (50: 50, V/V), abhängig von der Detektor Signalintensitäten. Tune das Massenspektrometer mit der Autotune-Funktion oder machen eine manuelle Abstimmung für die folgenden übergeordneten-Tochter Ionen Übergänge14: Hemmhof (481.0 > 167.0/395.7), Hemmhof -13C12D3 (485.1 > 167.1 / 400,0), Meropenem (384,1 > 114.0/141.0), Meropenem-D6 (390.1 > 114.0/147.2), Ciprofloxacin (332.0 > 231.0/245.0), Ciprofloxacin-D8 (340.1 > 235.1/249.3), Moxifloxacin (402.0 > 261.0/383.9), Moxifloxacin-13 C1D3 (406,1 > 265.1/388.0), Linezolid (338.0 > 235.0/296.0), Linezolid-D3 (341,1 > 235.1/297.1), Piperacillin (518.0 > 143.0/358.9), und Piperacillin-D5 (523.1 > 142.8/364.1).</li>
	<li>Verwenden Sie für Instrumente mit Autotuning die Autotune-Funktion zur automatischen Anpassung der Spannung und Einstellungen von MS-Einlass durch die Detektoren.</li>
	<li>Für Instrumente mit Handabstimmung, passen Sie die Einstellungen (z.B., Kollision Spannung und Aufprallenergie) bis das Optimum (in der Regel das Maximum) wird am Detektor für jedes Elternteil und Tochter Ion Signalintensität gewonnen. Zum Beispiel schließen ein Mischpult t-Stück, liefern mobile Phase A und B (50: 50, V/V) mit 0,5 mL/min und kontinuierlich ziehen ordentlichen Antibiotika oder internen Standard mit einer Flussrate von 0,1 mL/min.</li>
</ol>(6) HPLC-MS/MS-Set-up
Hinweis: Verfügt das Massenspektrometer, HPLC-System (einschließlich des Autosamplers) und die entsprechende Software richten sich nach der Hersteller. Passen Sie die Massen-Spektrometer-Parameter und das Waschen-Verfahren gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
<ol><li>Speichern Sie die Massen-Spektrometer-Parameter in ein entsprechendes "MS tune Datei '. Verwenden Sie Elektrospray-Ionisation im positiven Modus (ESI +) für alle Analyte. Passen Sie die Ionen-Quelle-Einstellungen für das Gerät verwendet (z.B., eine Kapillare Spannung von 1,5 kV, einer Quelltemperatur von 120 ° C, einer zugeführten Temperatur von 400 ° C, einer zugeführten Gas-Durchfluss von 600 L/h, ein RF Objektiv Spannung von 0,1 V und eine Verweilzeit von 80 ms).</li>
	<li>Geben Sie den Analyten und internen Standards tune Parameter (z.B., Kapillare Spannung, Aufprallenergie) in eine "MS Datei '.</li>
	<li>Die Bedingungen festlegen, Autosampler wie folgt in die "Einlass-Datei": die Temperatur der Probe bei 10 ° C mit einem Limit von ± 5 ° C; Waschen-Sequenz bei 1 X Aufräum-waschen-Säuberung mit 600 µL purge Volume Ersatz.</li>
	<li>In den oben erwähnten "Einlass-Datei", Set der Durchfluss um 0,4 bzw. 0,5 mL/min, die Laufzeit auf 4 min, hohe Druckgrenze bis 345 Bar, und die Spalte Temperatur auf 30 ° C mit einem Limit von ± 5 ° C. Hinzufügen der Lösungsmittel Name des mobilen Phasen A und B und sie bis 7 % B/93% A "bzw." festgelegt.</li>
	<li>Programmieren der chromatographischen Gradient in der "Einlass-Datei" wie folgt: 0.00 – 0,10 min mit 7 % mobilen Phase B/93% A, 0,11 – 0,60 min mit 65 % mobilen Phase B/35% A, 0,61-2.10 min mit 95 % mobilen Phase B/5% A, 2.11 – 4.00 min mit 7 % mobilen Phase B/93% A. Hinweis: Berechnen Sie die Spalte Extra Volumen, halterlosen Volumen für die instrumentale Plattform und die Analyten Aufbewahrung Faktoren wie in der USP < 621 > Chromatographie Leitlinie16beschrieben.</li>
</ol>7. Probe Messung Masterdatei
Hinweis: Mit der "Probe-Messung-master-Datei", der Patientenproben werden angegeben, die HPLC-MS/MS-Analyse wird gestartet, und die Datenauswertung erfolgt. Zwei separate Template-Dateien, darunter ein paar - und hochwertige Steuerung entstehen; eine Vorlage enthält QC paar A und C, der andere ein QC paar B und D.
<ol><li>Erstellen Sie eine neue "Probe-Messung-master-Datei". Wählen Sie die oben genannten "MS tune Datei", "MS-Datei", und 'Einlass File' (siehe Abschnitt 6), fügen Sie sie in jeder Probe-Zeile, und geben Sie das Injektionsvolumen mit 15 µL.</li>
	<li>Fügen Sie in aufsteigender Reihenfolge hinzu "Beispieltext" für Kalibratoren 0 – 7 und Qualitätskontrolle (QC) Paar a/c oder QC paar b/d.</li>
	<li>Geben Sie die Probe. Wählen Sie die Probe "Standard" für die Kalibratoren und "QC" für die Qualitätskontrolle-Paare.</li>
	<li>Geben Sie die Konzentration der einzelnen antibiotische Substanz für die entsprechenden Kalibratoren und Qualitätskontrollen (siehe Tabelle, Konzentration [µg/mL] Cal 7 – Cal 0 QC a/c oder b/d,).</li>
	<li>Programm der "Data-Bewertung-Methode". Verwenden Sie die Übergänge, die optimiert wurden, während das Instrument tuning (Abschnitt 5). Jedes Antibiotikum mit dem entsprechenden Isotopen-Label Standard (z.B. Meropenem - Meropenem-D6) entsprechen.</li>
</ol>(8) probieren Sie bereinigen und HPLC-MS/MS-Analyse
Hinweis: Für jede Probe Charge ist eine gekoppelte Qualitätskontrolle setzen mit einer niedrigen und hohen Antibiotika-Konzentration (QC a/c oder QC b/d) verarbeitet und analysiert. Zwischen verschiedenen Chargen der gekoppelten QC Proben werden in einer anderen Sequenz verwendet (z.B.an Tag 1, wählen Sie die "Probe-Messung-master-Datei" einschließlich QC koppeln a/c, am Tag 2, wählen Sie ein einschließlich QC paar b/d. Die Verarbeitung der Serumproben ist in Abbildung 1dargestellt.
<ol><li>Vorbereiten des fällungsmittels 10 % Methyl -Tert-Butyl-Äther in Methanol (10: 90, V/V) (z.B., vorkonfigurieren einen 25-mL-volumetrischen Kolben mit 2,5 mL Methyl -Tert-Butyl-Äther und füllen Sie ihn bis 25 mL mit absoluten Methanol).</li>
	<li>Ort der C8 umgekehrter Phase in die Spalte-Kammer. Verbinden Sie es mit der HPLC und Massenspektrometer in die Richtung der Strömung.</li>
	<li>Die Liste mit den zu generieren. Öffnen Sie die entsprechende "Probe-Messung-master-Datei" Vorlage und fügen Sie die Patientenproben der Liste bearbeitet werden soll. Gruppen von bis zu 20 Patientenproben zu generieren und mit dem entsprechenden Qualitätskontrolle-paar zu flankieren.</li>
	<li>Nass-Prime HPLC System mit der "Einlass-Datei" Steuerungs-Software: die "nassen Prime" Funktion auf 50 % mobilen Phase A/50% B und nass-Prime für 2 min bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min.</li>
	<li>Aktualisieren Sie die Spritze. Hierzu führen Sie 6 Schläge von 600 µL in der Steuerungssoftware.</li>
	<li>Equilibrate der Spalte C8 umgekehrter Phase. Mit der Software, schalten Sie die Strömung in der "Einlass-Datei" und spülen Sie es mit 7 % mobile Phase B/93% A für ein Minimum von 5 min, mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 mL/min überprüfen die Spalte Temperatur von 30 ° C.</li>
	<li>Auftauen der Patientenproben, ein Aliquot der Kalibratoren 0 – 7 und eine Qualitätskontrolle-Paar (A / B oder C/D).</li>
	<li>Fügen Sie mit einer sich wiederholenden Pipette 25 µL des internen standard Mix zum 100 µL Kalibrator, QC Probe oder Patientenserum in einem 1,5 mL Polypropylen Röhrchen und Wirbel der Röhre für ein paar Sekunden hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung für 5 min bei Raumtemperatur auf einem Benchtop-Shaker (z. B.bei 1.200 u/min).</li>
	<li>Fügen Sie mit einer sich wiederholenden Pipette 150 µL Reagenz einen Niederschlag zu der Probe-interne standard-Mix hinzu.</li>
	<li>Wieder Wirbel das Rohr für ein paar Sekunden und 5 min bei Raumtemperatur auf einem Benchtop-Shaker (z. B.bei 1.200 u/min) inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Federung bei 20.000 X g in einer Tischplatte Zentrifuge für 10 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Verdünnen Sie den überstand 1:3 mit HPLC Grade Wasser und ein Glasfläschchen mit einem Mikro-Einsatz zu und laden Sie es als Proben zu den Autosampler.</li>
	<li>Manuell starten die HPLC-MS/MS-Analyse der "Probe-Messung-Kontroll-Datei". Hinweis: Bei längerer Lagerung spülen Sie gründlich die analytische Säule nach Empfehlung des Herstellers [z.B.0,5 mL/min Methanol-Wasser (50: 50, V/V)] um Phase Zusammenbruch zu verhindern.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58148/58148fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Probe Bereinigung. Proteinfällung an die hohe Zentrifugalkraft gibt einen dichten Pellet und klaren überstand, angibt, dass Proteinfällung abgeschlossen war. Die gesamte Bearbeitungszeit beträgt ca. 30 Minuten, einschließlich der Probe-Bereinigung, die chromatographische Trennung und MS/MS-Analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58148/58148fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
9. Beurteilung und Quantifizierung
<ol><li>Um die Proben zu bearbeiten, öffnen Sie die entsprechende "Probe Messung Steuerdatei", wählen Sie die Kalibratoren, Kontrollen und Patientenproben und bewerten sie mit der "Antibiotika Quantifizierungsmethode".
</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob die Gipfel für einen bestimmten Analyten richtig integriert sind. Kontrollieren Sie die Gipfel für jeden Kalibrator, QC und Patientenprobe und reintegrieren sie manuell an der Grundlinie zu, falls erforderlich.</li>
	<li>Die Eichkurve zu studieren und zu prüfen, ob es die folgenden Qualitätskriterien erfüllt: (a) Linearität über die gesamte Kalibrierung Range, (b) eine Kalibrierung Koeffizienten R2 > 0.995, (c) die Abweichung jedes Kalibriernormal innerhalb von ± 15 % der Nennwert, außer für die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ), wo ± 20 % erforderlich ist.</li>
	<li>Ablehnen eines Kalibrierung Standards nicht mit den oben genannten Kriterien erfüllen und die Eichkurve, einschließlich der Regressionsanalyse neu zu bewerten.</li>
	<li>Untersuchen Sie die Qualitätskontrollen zu und prüfen Sie, ob die Abweichungen innerhalb von ± 15 % des Nennwertes.</li>
	<li>Übersteigt die Konzentration von einer Patientenprobe die Konzentration von der höchsten Kalibrator, verdünnen Sie die Probe mit destilliertem Wasser bis auf 1:5 (z.B. 100 µL Serum plus 400 µL destilliertes Wasser) vor der Probe-Bereinigung. Reperform Schritte 8,8 – 8.14 für dieses spezifische Beispiel und verarbeiten es.</li>
</ol>

<ol>
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B., Lipman, J., Roberts, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+we+use+therapeutic+drug+monitoring+to+improve+outcomes+from+severe+infections+in+critically+ill+patients?.">How do we use therapeutic drug monitoring to improve outcomes from severe infections in critically ill patients?.</a> BMC Infectious Diseases. 14, 288 (2014).</li><li>. Cefepime hydrochloride: Highlights of prescribing information Available from: <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/050679s040lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/050679s040lbl.pdf</a> (2016)</li><li>. Meropenem: Highlights of prescribing information Available from: <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2008/050706s022lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2008/050706s022lbl.pdf</a> (2006)</li><li>. Ciprofloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information Available from: <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/019537s086lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/019537s086lbl.pdf</a> (2016)</li><li>. Moxifloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information Available from: <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf</a> (2010)</li><li>. Linezolid: Highlights of prescribing information Available from: <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf</a> (2011)</li><li>. Piperacillin and Tazobactam: Highlighs of prescribing information Available from: <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf</a> (2017)</li><li>Zander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+biobanking+conditions+on+six+antibiotic+substances+in+human+serum+assessed+by+a+novel+evaluation+protocol.">Effects of biobanking conditions on six antibiotic substances in human serum assessed by a novel evaluation protocol.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 54 (2), 265-274 (2016).</li><li>Zander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+piperacillin,+tazobactam,+cefepime,+meropenem,+ciprofloxacin+and+linezolid+in+serum+using+an+isotope+dilution+UHPLC-MS/MS+method+with+semi-automated+sample+preparation.">Quantification of piperacillin, tazobactam, cefepime, meropenem, ciprofloxacin and linezolid in serum using an isotope dilution UHPLC-MS/MS method with semi-automated sample preparation.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 53 (5), 781-791 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir berichten in diesem Manuskript, das Protokoll für eine einfache und robuste Tandem-Massenspektrometrie-basierte Methode zur Quantifizierung der häufig verwendeten Antibiotika in ICU19, nämlich Hemmhof, Meropenem, Ciprofloxacin, Moxifloxacin, Linezolid, und Piperacillin14. Eine Tabellenkalkulation begleitet das Manuskript für die Zubereitung von Antibiotika Stammlösungen, Kalibratoren und Qualitätskontrollen, unter Berücksichtigung der Reinheit der Antibiotika und...

Obwohl Antibiotika die medizinische Praxis revolutioniert haben, bleiben schwere bakterielle Infektionen eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei kritischen Krankheiten1. In diesem Zusammenhang ist die schnelle Verwaltung der einen passenden Antiinfektiva in ein ausreichender Dosierung von größter Bedeutung für Disease Control2.
Eine wachsende Zahl von beweisen zeigt, dass die empirische Behandlung mit Breitbandantibiotika mit der Komplexität der Patientenpopulationen zunehmend problematisch wird. Dies gilt insbesondere für die Intensivstation (ICU), wo eine große interindividuelle Variabilität der Schlüsselparameter pharmakokinetischen (PK) häufig beobachtet wird,3,4. Dementsprechend sind Intensivpatienten drohende Gefahr Sub therapeutischen Spiegel mit der Gefahr einer unzureichenden Therapieerfolg5,6. Dann wieder sind Patienten unnötig zu hohe antibiotische Konzentrationen ausgesetzt, die zu schwerwiegenden unerwünschten Ereignisse mit keine klinischen Vorteile7führen kann. Die Antibiotika Missbrauch und die unzureichende Dosierung haben auch die Verbreitung von Antibiotika-Resistenzen, angeheizt werdenden eine wachsende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit8.
Um den Einsatz von Antibiotika zu verbessern und ihre Effectivenessas zu bewahren hat lange wie möglich, der World Health Organization einen globalen Aktionsplan zur Antibiotikaresistenz in 20159ins Leben gerufen. Antibiotikum Stewardship-Programme sind einen wesentlichen Eckpfeiler des umsichtigen antimikrobielle Einsatz in national Public Health Strategien10helfen Kliniker, die Qualität der Patientenversorgung11 und zur gleichen Zeit erheblich zu verbessern Reduktion der Antibiotika-Resistenz-12. Antimikrobiellen Dosierung bei einzelnen Patienten durch die Anwendung von therapeutischen Drug monitoring (TDM) ist ein zentrales Instrument in diesem Zusammenhang13.
Bis heute im Handel erhältlichen TDM sind Tests nur für Glycopeptide Antibiotika und Aminoglykoside. Die Quantifizierung von Substanzen aus anderen Klassen erfordert häufig eine Hausmethode Entwicklung oder Validierung, die umständlich sein kann. Daher präsentieren wir, im Detail das Protokoll für eine robuste Massenspektrometrie-basierte Test, die für die Quantifizierung der wichtigsten Antibiotika auf der Intensivstation innerhalb ihrer klinischen relevanten Konzentration reicht14verwendet werden kann. Die Methode wurde vor kurzem in unserem Massenspektrometrie gegründet und gilt seitdem für die Routine TDM auf der Intensivstation. Das Verfahren nutzt eine unkomplizierte und einfache analytische Einstellung mit einem einheitlichen Muster-Bereinigung, ermöglicht die schnelle Umsetzung von Antibiotika TDM in vielen Einrichtungen mit Massenspektrometrie-Funktionen.
Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert für die Quantifizierung der Hemmhof, Meropenem, Ciprofloxacin, Moxifloxacin, Linezolid und Piperacillin in humanem Serum mit Isotop Verdünnung Flüssigchromatographie (LC) in Kombination mit einem Tandem Mass Massenspektrometrie (MS/MS). Für das Isotop Verdünnung LC-MS/MS-Methode sind stabile Isotopen-markierte Verbindungen auf eine Stichprobe von Interesse mit einer bestimmten Matrix (z.B. Serum) hinzugefügt. Isotopen-markierte Normen können von ihren unbeschriftete Gegenstück, nämlich der Analyten von Interesse, durch verschiedene Molekulargewichte natürliches Molekül und deren Fragmentierung Produkte, bezeichnet einen übergeordneten Ion, Tochter Ion Übergang unterschieden werden. Isotopen-markierte Verbindungen eine fast identische insgesamt physikalisch-chemischen Verhalten im Vergleich zu ihren unbeschriftete Gegenstück haben, sind sie ideale interne Standards für MS/MS, ermöglicht eine nahezu Matrix-unabhängige Analyten Quantifizierung mit einem hohen Maß an Genauigkeit-15. Heutzutage sind viele stabile Isotopen-Label interne Standards, die für die kleinen-Molekül Quantifizierung, einschließlich der TDM von Antibiotika, einsetzbar im Handel erhältlich.
Die chromatographische Trennung der Antibiotika Analyten in der beschriebenen Protokoll erfolgt mit einem C8 Alkyl-Kettenlänge Reverse-Phase Trennsäule (100 mm x 2,1 mm, 3 µm-Partikelgröße). Während der Methodenentwicklung war der interne standard normalisierten Matrix Faktoren für alle Analyte 94,6 % bis 105,4 %, mit einem Variationskoeffizienten von ≤8.3 %14.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>cefepime hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1097636</td>
			<td>USP Reference Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meropenem trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0001252</td>
			<td>EP Reference Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>moxifloxacin hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML1581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linezolid</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>L466500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperacillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefepime-13C12D3 sulfate</td>
			<td>Alsachim</td>
			<td>C1297</td>
			<td>Isotope labelled internal standard for cefepime</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meropenem-D6</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>M225617</td>
			<td>Isotope labelled internal standard for meropenem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ciprofloxacin-D8</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C482501</td>
			<td>Isotope labelled internal standard for ciprofloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>moxifloxacin-13C1D3 hydrochloride</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>M745003</td>
			<td>Isotope labelled internal standard for moxifloxacin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>linezolid-D3</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>L466502</td>
			<td>Isotope labelled internal standard for linezolid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piperacillin-D5</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P479952</td>
			<td>Isotope labelled internal standard for piperacillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>8402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>6914132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>1070501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70221-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tert-Butyl methyl ether</td>
			<td>Merck</td>
			<td>101845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fortis 3 &#956;m C8 100 * 2.1 mm</td>
			<td>Fortis</td>
			<td>F08-020503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti-PEEK-encased Prifilter (2 &#956;m)</td>
			<td>Chromsystems</td>
			<td>15011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2795 Alliance HPLC system</td>
			<td>Waters</td>
			<td>176000491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quattro micro API Tandem Quadrupole System</td>
			<td>Waters</td>
			<td>720000338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuanLynx 4.1 software</td>
			<td>Waters</td>
			<td>/</td>
			<td>Data evaluation software provided by the mass spectrometer manufacturer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex therapeutic drug monitoring by isotope-dilution hplc-ms/ms of antibiotics in critical illnesses

Es gibt eine steigende Nachfrage für das therapeutisches Drug monitoring von Antibiotika in vielen klinischen Einrichtungen, insbesondere im Hinblick auf die Umsetzung des Krankenhaus Antibiotika Stewardship-Programme.
Bei den laufenden Arbeiten präsentieren wir ein Multiplex-leistungsstarke flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS)-Protokoll für die Quantifizierung der Hemmhof, Meropenem, Ciprofloxacin, Moxifloxacin, Linezolid und Piperacillin, häufig verwendet Antibiotika auf Intensivstationen. Die Methode wurde bereits umfassend nach der Richtlinie der Europäischen Arzneimittel-Agentur überprüft.
Nach einer rasanten Probe Bereinigung Analyten getrennt auf einem C8-Reverse-Phase-HPLC-Säule innerhalb von 4 Minuten und mit der entsprechenden stabilen Isotopen-Label internen Standards in der Elektrospray-Ionisation (ESI +) Massenspektrometrie in mehreren Reaktion quantifiziert Zeit mit der Überwachung (MRM). Die vorgestellte Methode verwendet eine einfache Instrumentierung mit einheitlicher chromatographische Bedingungen einstellen, so dass für das tägliche und robuste Antibiotika therapeutisches Medikament monitoring in klinischen Labors. Die Eichkurve erstreckt sich über die pharmakokinetischen Konzentrationsbereich, damit einschließlich Antibiotika Beträge in der Nähe der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) der Bakterien anfällig und Konzentrationen (Cmax), die mit Bolus abgerufen werden Verwaltung-Schemata. Ohne die Notwendigkeit der Serum-Verdünnung vor der Probe-Bereinigung erhalten Sie durch mehrere Messungen der Fläche unter der Kurve für ein Antibiotikum verabreicht.

Mit der beschriebenen Protokoll, ist ein typisches Chromatogramm in Abbildung 2dargestellt. Gemäß dem United States Pharmacopeia (USP) Chromatographie Leitlinien16, wurde die Spalte Totvolumen im derzeitigen System mit ~0.22 mL und die Spalte Extra Volumen (einschließlich der Injektor, Schläuche und Anschlüsse) mit ~0.08 mL bestimmt geben ein Bankraub Volumen von ~0.30 mL. Die berechneten Aufbewahrung Faktoren für alle Analyte wa...

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Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses

Multiplex-therapeutisches Drug Monitoring von Isotop-Verdünnung HPLC-MS/MS von Antibiotika in der kritischen Krankheiten

Hier präsentieren wir ein Tandem Massenspektrometrie-basierte Protokoll für die Quantifizierung von häufig verwendeten Antibiotika auf Intensivstationen, nämlich Hemmhof, Meropenem, Ciprofloxacin, Moxifloxacin, Linezolid und Piperacillin.

There is an ever-increasing demand for the therapeutic drug monitoring of antibiotics in many clinical facilities, particularly with regard to the ...

multiplex-therapeutic-drug-monitoring-isotope-dilution-hplc-msms

Research

JoVE Journal

Medicine

12.8K Aufrufe.  LMU Munich. Hier präsentieren wir ein Tandem Massenspektrometrie-basierte Protokoll für die Quantifizierung von häufig verwendeten Antibiotika auf Intensivstationen, nämlich Hemmhof, Meropenem, Ciprofloxacin, Moxifloxacin, Linezolid und Piperacillin.

Serie: Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses

Bronchial Thermoplasty:  A Novel Therapeutic Approach to Severe Asthma

Bronchial thermoplasty is a non-drug procedure for severe persistent asthma that delivers thermal energy to the airway wall in a precisely controlled manner to reduce excessive airway smooth muscle. Reducing airway smooth muscle decreases the ability of the airways to constrict, thereby reducing the frequency of asthma attacks. Bronchial thermoplasty is delivered by the Alair System and is performed in three outpatient procedure visits, each scheduled approximately three weeks apart. The first procedure treats the airways of the right lower lobe, the second treats the airways of the left lower lobe and the third and final procedure treats the airways in both upper lobes. After all three procedures are performed the bronchial thermoplasty treatment is complete.
Bronchial thermoplasty is performed during bronchoscopy with the patient under moderate sedation. All accessible airways distal to the mainstem bronchi between 3 and 10 mm in diameter, with the exception of the right middle lobe, are treated under bronchoscopic visualization. Contiguous and non-overlapping activations of the device are used, moving from distal to proximal along the length of the airway, and systematically from airway to airway as described previously. Although conceptually straightforward, the actual execution of bronchial thermoplasty is quite intricate and procedural duration for the treatment of a single lobe is often substantially longer than encountered during routine bronchoscopy. As such, bronchial thermoplasty should be considered a complex interventional bronchoscopy and is intended for the experienced bronchoscopist. Optimal patient management is critical in any such complex and longer duration bronchoscopic procedure. This article discusses the importance of careful patient selection, patient preparation, patient management, procedure duration, postoperative care and follow-up to ensure that bronchial thermoplasty is performed safely.
Bronchial thermoplasty is expected to complement asthma maintenance medications by providing long-lasting asthma control and improving asthma-related quality of life of patients with severe asthma. In addition, bronchial thermoplasty has been demonstrated to reduce severe exacerbations (asthma attacks) emergency rooms visits for respiratory symptoms, and time lost from work, school and other daily activities due to asthma.

Bronchial thermoplasty is a non-drug procedure for severe persistent asthma that delivers thermal energy to the airway wall in a precisely controlled manner to reduce excessive airway smooth muscle. Reducing airway smooth muscle decreases the ability of the airways to constrict, thereby reducing the frequency of asthma attacks.

Bronchial Thermoplastie: einen neuen therapeutischen Ansatz bis schwerem Asthma

Bronchial thermoplasty is a non-drug procedure for severe persistent asthma that delivers thermal energy to the airway wall in a precisely controlled ...

Forschung

Medizin

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

In vivo Messung der Maus Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Eine erschwingliche HIV-1 Drug Resistance Überwachungsmethode für Ressourcen Begrenzte Einstellungen

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Eine einfache Kritische große Femoral Defect Modell an der Maus

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

Verwendung von Ultrahochfeld-MRT in Kleintier Modelle aus Polyzystische Nierenerkrankung für<em&gt; In Vivo</em&gt; Phänotypisierung und Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Einrichtung eines segmentalen Femoral Critical-size Defektmodell in Mäusen durch Plattenosteosynthese Stabilisierte

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

Standardized Hemorrhagic Shock Induction Guided by Cerebral Oximetry and Extended Hemodynamic Monitoring in Pigs

Hemorrhagic shock ranks among the main reasons for severe injury-related death. The loss of circulatory volume and oxygen carriers can lead to an insufficient oxygen supply and irreversible organ failure. The brain exerts only limited compensation capacities and is particularly at high risk of severe hypoxic damage.This article demonstrates the reproducible induction of life-threatening hemorrhagic shock in a porcine model by means of calculated blood withdrawal. We titrate shock induction guided by near-infrared spectroscopy&#160;and extended hemodynamic monitoring to display systemic circulatory failure, as well as cerebral microcirculatory oxygen depletion. In comparison to similar models that primarily focus on predefined removal volumes for shock induction, this approach highlights a titration by means of the resulting failure of macro- and microcirculation.

Hemorrhagic shock is a severe complication in seriously injured patients, which leads to life-threatening oxygen undersupply. We present a standardized method to induce hemorrhagic shock via blood withdrawal in pigs that is guided by hemodynamics and microcirculatory cerebral oxygenation.

Standardisierte hämorrhagische Schockinduktion geführt durch Zerebrale Oximetrie und erweiterte hämodynamische Überwachung bei Schweinen

Hemorrhagic shock ranks among the main reasons for severe injury-related death. The loss of circulatory volume and oxygen carriers can lead to an ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

Beurteilung der therapeutischen Angiogenese in einem Murine-Modell von Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

A Rat Carotid Artery Pressure-Controlled Segmental Balloon Injury with Periadventitial Therapeutic Application

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the luminal surface area in arteries thereby reducing adequate blood flow to organs and distal tissues. Clinically, revascularization procedures such as balloon angioplasty with or without stent placement aim to restore blood flow. Although these procedures reestablish blood flow by reducing plaque burden, they damage the vessel wall, which initiates the arterial healing response. The prolonged healing response causes arterial restenosis, or re-narrowing, ultimately limiting the long-term success of these revascularization procedures. Therefore, preclinical animal models are integral for analyzing the pathophysiological mechanisms driving restenosis, and provide the opportunity to test novel therapeutic strategies. Murine models are cheaper and easier to operate on than large animal models. Balloon or wire injury are the two commonly accepted injury modalities used in murine models. Balloon injury models in particular mimic the clinical angioplasty procedure and cause adequate damage to the artery for the development of restenosis. Herein we describe the surgical details for performing and histologically analyzing the modified, pressure-controlled rat carotid artery balloon injury model. Additionally, this protocol highlights how local periadventitial application of therapeutics can be used to inhibit neointimal hyperplasia. Lastly, we present light sheet fluorescence microscopy as a novel approach for imaging and visualizing the arterial injury in three-dimensions.

The rat carotid artery balloon injury mimics the clinical angioplasty procedure performed to restore blood flow in atherosclerotic vessels. This model induces the arterial injury response by distending the arterial wall, and denuding the intimal layer of endothelial cells, ultimately causing remodeling and an intimal hyperplastic response.

Eine Ratte Carotis Arterie Druck-kontrollierte segmentale Ballonverletzung mit periadventitialen therapeutischen Anwendung

Cardiovascular disease remains the leading cause of death and disability worldwide, in part due to atherosclerosis. Atherosclerotic plaque narrows the ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

Validiertes LC-MS/MS Panel zur Quantifizierung von 11 medikamentenresistenten TB-Medikamenten in kleinen Haarproben

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...