Keio koleksiyonu suşları Ulusal BioResource (Zen, Japonya) projeden elde: E. coli. Dirk Linke (Biosciences bölümü, Oslo Üniversitesi) onun sürekli destek için teşekkür ederiz. Bu eser Norveç genç araştırmacı hibe 249793 (Jack C. Leo) araştırma kurumu tarafından finanse edildi.

1. suşları ve Plazmidlerin
<ol><li>
Bakteri suşları
	<ol>
<li>E. coli suşları BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7, BL21(DE3)20ve BL21ΔABCF21kullanın. Malzemeler tablo daha fazla bilgi için bkz:.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bacteriophages
	<ol>
<li>Feyc P1vir genel iletim için kullanın. Kloroform birkaç damla ile sıvı bir hisse senedi olarak faj saklamak (bkz. Adım 2.2). Daha fazla bilgi için bkz: Tablo reçetesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plazmid
	<ol>
<li>Bu protokol için aşağıdaki plazmid kullanın: pCP2022, pIBA2 YadA23ve pEibD1024. Denetim plazmid pASK-IBA2 ve pET22b ( Tablo malzemelerigörmek) kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Büyüme koşulları
	<ol>
<li>Dinç (180-200 devir/dakika) 37 ° C veya 30 ° C durumunda BL21ΔABCF ve pCP20 içeren suşları sallayarak bir lysogeny suyu (LB) orta25 bakteri yaymak.</li>
		<li>43 ° C'de kür plazmid gerçekleştirmek</li>
		<li>Sağlam bir orta için LB %1 agar (w/v) ile ek.</li>
		<li>En iyi agar için LB %0,7 agar ve 10 mM CaCl2 ve otoklav orta ile ek. SOC orta Elektroporasyon26sonra kurtarma için kullanın.</li>
		<li>Aşağıdaki konsantrasyonları için antibiyotik kullanmak: 100 μg/mL Amp ve 25 μg/mL kan için</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bir fajının Lysate hazırlanması
<ol><li>
Enfeksiyon büyük donör yük
	<ol>
<li>10 mM CaCl2 ve isteğe bağlı olarak Kan ile desteklenmiş LB orta 5 ml donör zorlanma JW4197 büyümek (25 µg/mL) için bir optik yoğunluk 600 nm ~ 1.0 (OD600). Bir spektrofotometre kullanarak OD600 değerini ölçmek.</li>
		<li>Varolan bir P1 fajının stok seyreltme dizi LB ortamda yapmak: dilutions 10-7için 10-3 arasında önerilir.</li>
		<li>Mix 200 μL bakteriyel süspansiyon ve verilen fajının seyreltme 15 mL santrifüj tüpü veya eşdeğeri 100 μL. Çok sayıda tüpler fajının dilutions hazırlayın. Tüpler 37 ° C'de 20 dk için sallayarak olmadan kuluçkaya.</li>
		<li>Tüpler için 10 mM CaCl2 ile takıma erimiş üst agar (~ 50 ° C) ~ 3 mL ekleyin, içeriği iyice kısa bir süre tüpler vortexing tarafından mix ve karışımları hatta katmanlar yapmak prewarmed LB plakalar üzerine dökün.</li>
		<li>Plakayı gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysate hazırlık
	<ol>
<li>Ertesi gün bir tabak yarı konfluent büyüme fajının plaklar ile seçin. Yarı konfluent bir plaka üzerinde yaklaşık yarım yüzey alanı plaka açıktır (Şekil 3).</li>
		<li>Bir aşı döngü veya benzer bir aracı kullanarak böyle bir tabak üst agar katmandan scrape ve üst agar bir santrifüj tüpü yerleştirin. 1-2 mL lb ve kloroform ve girdap şiddetle ~ 1 dk. Ekle kloroform için tüp bir damla duman mahallede ekleyin.</li>
		<li>Tüp agar ve bakteri hücreleri cips için 4000 g x veya daha hızlı, 15 dk santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant Pelet üzerinden herhangi bir enkaz üzerinde taşıyan kaçınarak bir taze microcentrifuge tüp taşıyın. Kloroform 2 damla ekleyin ve lysate 4-10 ° C'de depolayın Kloroform duman mahallede ekleyin. Faj-değil var dondurmak lysate gibi bu bulaşıcı parçacık sayısı önemli bir azalma sonuçlanır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysate titresi belirleme
	<ol>
<li>BW25113 37 ° C'de 10 mM CaCl2 ile kültür bir OD600 ~ 1.0 ulaşır kadar takıma LB içinde büyümek.</li>
		<li>Feyc LB (Örneğin, 10-6–10-9) lysate bir seyreltme dizi hazırlamak. Not: damlalıklı örnek üst lysate dilutions için kloroform aktarılmasını önlemek için dikkatli olun.</li>
		<li>Mix 200 μL bakteriyel süspansiyon ve verilen fajının seyreltme 15 mL santrifüj tüpü veya eşdeğeri 100 μL. Çok sayıda tüpler fajının dilutions hazırlayın. Tüpler 37 ° C'de 20 dk için sallayarak olmadan kuluçkaya.</li>
		<li>Tüpler için 10 mM CaCl2 ile takıma erimiş üst agar (~ 50 ° C) ~ 3 mL ekleyin, içeriği iyice kısa bir süre tüpler vortexing tarafından mix ve hatta katmanlar yapmak prewarmed LB plakalar üzerine karışımı dökün.</li>
		<li>Plakayı gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Ertesi gün plaklar (bakteriyel mat açık bölgelerde) her plaka için sayma ve titresi lysate aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg"> Örnek: dilutions 10-7, 10-8ve 10-9ile levha üzerinde orada 231, 27 ve 2 plaklar, sırasıyla. Her seyreltme 100 μL enfeksiyonu için kullanılan gibi ve titresi plak şekillendirme olarak ifade edilir çünkü birimleri (pfu) / mL, kaplama faktör 10. Bu sayılar formüle girilir: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg"> Böylece, titresi yaklaşık 2 x 1010 bulaşıcı fajının parçacıklar/ml'dir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. P1 iletim
<ol><li>
Alıcı hücreler hazırlanıyor
	<ol>
<li>Alıcı zorlanma BL21ΔABCF 600 optik bir yoğunluk için takıma LB büyümek nm ~ 1.0 (OD600). Bir spektrofotometre OD600 değeri ölçmek için kullanın.</li>
		<li>Enfeksiyon (MOI) değeri 0,5 çokluğu sağlanması için gerekli lysate fajının hacmi hesaplamak. MOI hesaplamak için bakterileri OD600 kültür göre sayısını tahmin ediyoruz. Bir OD600 değerinin 1.0 ~ 109 cfu/mL karşılık geldiği varsayılmaktadır. Gerekli birim üzerinde lysate titresi bilinen dayalı hesaplamak. Örnek: (-den sonra adım 2.3.6 örnekte hesaplanan titresi bağlı olarak) <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg">
</li>
		<li>10 mM için alıcı zorlanma kültürüne CaCl2 ekleyip karıştırın. Kültür iletim için 1 mL al.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İletim gerçekleştirme
	<ol>
<li>Feyc lysate uygun hacmi 1 mL (10 mm CaCl2 dahil) alıcı kültür 3.1.2. adımda hesaplanan ekleyin ve karışımı yavaşça. Not: örnek lysate karıştırmak için kloroform aktarılmasını önlemek için üst pipette için dikkatli olun.</li>
		<li>Statik olarak 37 ° C'de 20 dk için karışımı kuluçkaya</li>
		<li>Enfeksiyon için 100 mM sodyum sitrat, pH 5.5, ekleyerek durdurmak.</li>
		<li>Bakteri (5000 x g için 2 dk) santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın ve sonra onları taze LB ile 100 mM sodyum sitrat, pH 5.5 takıma 1 ml resuspend.</li>
		<li>İki kez daha fazla adım 3.2.4 ücretsiz phages ve kalsiyum kaldırılmasını sağlamak için olduğu gibi hücreleri yıkayın.</li>
		<li>1 mL taze lb 100 mM sodyum sitrat, pH 5.5 ile desteklenmiş bakterilerde resuspend. Bakteri (> 100 rpm) sallayarak ile 1 h için 30 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Santrifüjü (5000 x g için 2 dk) tarafından bakteri toplamak ve onları LB ~ 100 μL 100 mM sodyum sitrat, pH 5.5 ile resuspend.</li>
		<li>25 µg/mL ve 10 mM sodyum sitrat, pH 5.5, Kan ile desteklenmiş bir LB plaka üzerinde bakteri yaymak ve 30 ° C'de bakteri kolonileri (~ 24 h) görününceye büyür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transductants seçme
	<ol>
<li>Koloniler seçimi plaka üzerinde büyüdü sonra onları restreak LB + Kan için tek kolonileri ve tek kolonileri görünür kadar 30 ° C'de büyür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Kan kaset bilincin
<ol><li>
Rekombinasyon plazmid ile dönüştürme
	<ol>
<li>Kan dayanıklı BL21ΔABCF gerilme electrocompetent olun.<ol>
<li>Taze LB (5 mL) Kan ile desteklenmiş bir koloni gelen zorlanma büyümek (25 µg/mL) OD600 ~0.5 – 0,7 olana 30 ° C'de.</li>
			<li>Şu andan itibaren 4 ° C'de veya buz üzerinde aşağıdaki adımları uygulayın. Bakteri (5000 x g 10 dk) santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
			<li>İki kez önceki Santrifüjü adımı tekrar ederek hücre Pelet buz gibi soğuk distile su ile yıkama ve son olarak, hücre Pelet buz gibi % 10 gliserol 100 µL içinde resuspend.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 mm Elektroporasyon cuvettes buz üzerinde sakin.</li>
		<li>Plazmid DNA (pCP20) 1 pg hücre süspansiyon eklemek, süspansiyon karışımı yavaşça ve soğutmalı Elektroporasyon küvet aktarın.</li>
		<li>Electroporator 1.8 ayarla kV ve electroporate hücreleri.</li>
		<li>1 mL SOC orta ekleyerek ve onları 30 ° C'de 1 h için büyüyen dönüştürülmüş hücreleri kurtarmak</li>
		<li>100 µL LB hücrelerin plaka + Amp tabaklar ve 30 ° C'de hücreler gecede büyümek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rekombinasyon indüksiyon
	<ol>
<li>Çekme tek kolonileri LB + Amp plaka ve taze LB tüm antibiyotiklere atlama aşılamak.</li>
		<li>Hücreleri, Sigara keyfi sıcaklığında (43 ° C) gece FLP recombinase ifade ikna etmek için büyür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rekombinasyonlar seçme
	<ol>
<li>Seri dilutions yapmak ve non-selektif plakaları 105-106 seyreltme 50 µL plaka ve gecede 30 ° C'de büyür</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. gen silme doğrulanması
<ol><li>
Plazmid kaybı ve başarılı rekombinasyon doğrulama
	<ol>
<li>Çizgi tek kolonileri adım 4.3.1 LB + Kan, LB + Amp hazırlanan tabak ve LB plakaları olmadan antibiyotik, bu sırada. Çizgiler içinde yardım etmek için bir koloni kılavuzunu kullanın (bkz. ek dosya 1). Koloniler (~ 24 h) görününceye tabak 30 ° C'de büyümek.</li>
		<li>Non-selektif plaka üzerinde yetiştirilen, ancak daha fazla doğrulama için seçmeli medya büyümeye başarısız oldu 10-20 klonlar almak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Koloni PCR tarafından ek doğrulama
	<ol>
<li>Bir koloni PCR sıra kodlama tamA kanat astar ile gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>Bir ana PCR karışımı hazırlayın. Gerekli mix ( Tablo 1' deki örneğe bakın) test edilecek kolonileri sayısını bağlıdır. Buzda reaktifleri mix, polimeraz son ekleyin.</li>
		<li>PCR ana karışımı iyice karıştırın, sonra 20 µL PCR şerit tüpler içine dağıtmak. Her koloni steril pipet ucu kullanarak taranması için küçük bir miktar almak ve bir tüp için ekleyin. Orijinal alıcı türe ürününü karşılaştırma listesine eklemeyi unutmayın. İsteğe bağlı, ayrıca donör zorlanma içerebilir.</li>
		<li>PCR reaksiyon çalıştırmak (bkz. Tablo 2 program için kullanılır).</li>
		<li>% 1'özel jel hazırlayın.<ol>
<li>50 mL jel için özel 0.5 g ölçmek ve TAE arabellek (40 mM Tris, 20 mM asetik asit ve 1 mM EDTA, pH 8.0) 50 mL ekleyin. Tüm özel eriyene kadar karışımı fırın mikrodalga bir de ısı.</li>
			<li>Bir kez özel çözünmüş, çözüm için yaklaşık 50 ° C serin ve boya boyama DNA'ın 5 μL eklemek. Çözüm karıştırın ve bir döküm odası jel tepsisine içine dökün. Böylece tüm örnekleri yanı sıra moleküler boyutu işaretçileri için yeterli wells iyi tarak bir veya daha fazla satırı ekleyin. Jel 30 dk için ayarlamak izin verir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>6 x DNA yükleme boya 4 µL PCR çalışma tamamlandıktan sonra her örnek için ekleyin. Jel Elektroforez odasında yerleştirin ve kuyular kaplıdır kadar TAE arabellek ekleyin.</li>
		<li>10-15 µL jel bir kuyuda her PCR reaksiyon uygulayın. Ayrıca moleküler boyutu işaretleyicinin 5 µL ekleyin. Daha sonra 30 dk için jel 75 V çalıştırın.</li>
		<li>Çalışma tamamlandıktan sonra bir mavi ışık Imager kullanarak jel görüntü.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. diğer teknikleri
<ol><li>
Protein ifade Not: Test proteinler (YadA ve EibD) ifadesi oldu23,24başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu ana adımları kısa bir özetidir.<ol>
<li>BL21ΔABCF ΔtamA wITH gerekli plazmid (pIBA2-YadA ve pEibD10 ve karşılık gelen denetim plazmid) dönüştürmek ve transformants LB + Amp için seçin.</li>
		<li>Protein ifade için bir gecede kültür dönüştürülmüş bakteri 1 mL ile 100 mL LB orta + Amp aşılamak ve bunlar 30 ° C'de orta log fazı, ne zaman kadar büyümek, her iki anhydrotetracycline (100 ng/mL) adlı protein üretim teşvik veya İzopropil thiogalactoside (0.5 mM) de.</li>
		<li>İndüksiyon 30 ° C'de 2 h kültürlerin bulanıklık ölçmek ve 50 mL OD600 karşılık gelen hücre sayısı toplamak sonra = 1.0 kültürler 4.000 x gde 15 dakika centrifuging. Pelet yıkayın 1 x 10 mM HEPES ile pH 7,4 ve sonra da-20 ° C veya işlem adım 6.2 olduğu gibi daha fazla bu depolamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dış membran çıkarma Not: Leo vd tarafından ayrıntılı olarak açıklandığı gibi dış membran ayıklama gerçekleştirilir 27. ana adımları aşağıda özetlenmiştir.<ol>
<li>Resuspend hücre pelet 1 ml 10 mm HEPES, pH 7.4, takıma 10 mM MgCl2 ve MnCl2, lizozim (0.1 mg/mL) ve bir tutam DNaz ile ben.</li>
		<li>(Bir boncuk çırpıcı kullanarakÖrneğin,) hücreleri parçalayıcı.</li>
		<li>Kısa bir süre (15,600 x gde 2 dk) hücreleri hücre artıkları kaldırmak ve süpernatant temiz bir tüp taşımak için santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Hücreler için 16.000 x g, 30 dk sonra santrifüj kapasitesi, %1 N-lauroyl sarcosine 10 mm HEPES, pH 7.4 400 μL Pelet resuspend.</li>
		<li>Hangi sonra oda sıcaklığında 30 dakika ajitasyon hücrelerle kuluçkaya, onları yukarıdaki gibi 30 dk santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Yıkama saydam 1 x 10 mm HEPES, pH 7.4, 200 μL ile cips ve daha sonra 10 mM HEPES 30 μL içinde resuspend ve 4 SDS-sayfa örnek arabellek x 10 μL ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etkinlik deneyleri Not: SDS-sayfa ve etkinlik deneyleri tarif28YadA ve EibD için gerçekleştirin. Ana adımları aşağıda özetlenmiştir.</li>
	<li>
SDS-SAYFA
	<ol>
<li>Örnekleri 50 ° c 5 min için jel polyacrylamide proteinleri denaturing önlemek için, yüklemeden önce ısı.</li>
		<li>SDS-sayfa boşanmadan sonra polivinilidin difluoride (PVDF) membran proteinleri aktarın.</li>
		<li>Aktarımdan sonra membran PBS de %2 yağsız süt tozu ile engelleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
YadA-kollajen kadar western blot
	<ol>
<li>Belgili tanımlık kütük parçası sonra ben seyreltilmiş sığır kollajen türü engelleme arabellekte bir konsantrasyon 10 μg/mL için eklemek ve membran 1 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Membran 2 yıkama x PBS + %0,05 Tween20 ile (PBS-T).</li>
		<li>Membran için birincil antikor (monoklonal Anti-kollajen COL-1), seyreltilmiş 1:2,000 engelleme arabellekte ekleyin.</li>
		<li>1s için membran kuluçka sonra adım 6.3.2.2 belirtildiği gibi 2 x yıkayın ve ikincil antikor [keçi Anti-fare IgG-horseradish peroksidaz (HRP) eşlenik], seyreltilmiş 1:10,000 engelleme arabellekte ekleyin.</li>
		<li>Membran 1 h için kuluçkaya sonra yıka 2 x ile PBS-T. Membran üretici yönergelerine göre gelişmiş bir chemiluminescent substrat ekleyin ve grubun bir CCD kamera ile tespit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EibD-IgG bağlama tahlil
	<ol>
<li>Engelleme sonra ikincil antikor (keçi Anti-tavşan HRP), seyreltilmiş engelleme arabelleği 1:2,000 ekleyin.</li>
		<li>Membran 1 h için kuluçkaya sonra yıka 2 x PBS ile. Chemiluminescent adım 6.3.2.5 belirtildiği gibi saptaması.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blount, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unexhausted+potential+of+E.+coli.">The unexhausted potential of E. coli.</a> eLife. 4, e05826 (2015).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).</li><li>Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+precise+deletions+and+insertions+in+the+genome+of+wild-type+Escherichia+coli:+application+to+open+reading+frame+characterization.">Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization.</a> Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).</li><li>Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+in+vivo+genetic+engineering+in+E.+coli,+S.+enterica,+and+beyond.">Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond.</a> Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques:+Recombinogenic+engineering--new+options+for+cloning+and+manipulating+DNA.">Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+Keio+collection+of+Escherichia+coli+single-gene+deletion+mutants.">Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants.</a> Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).</li><li>Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+applications+of+systematic+in-frame,+single-gene+knockout+mutant+collection+of+Escherichia+coli+K-12.">The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12.</a> Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).</li><li>Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyamines+are+not+required+for+aerobic+growth+of+Escherichia+coli:+preparation+of+a+strain+with+deletions+in+all+of+the+genes+for+polyamine+biosynthesis.">Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).</li><li>Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+simvastatin+bioconversion+in+Escherichia+coli+by+deletion+of+bioH.">Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH.</a> Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).</li><li>Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+hydrogenase+3+is+a+reversible+enzyme+possessing+hydrogen+uptake+and+synthesis+activities.">Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).</li><li>Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disulfide+bond+formation+pathway+is+essential+for+anaerobic+growth+of+Escherichia+coli.">The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).</li><li>Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+approach+to+identify+the+genes+involved+in+biofilm+formation+in+E.+coli.">A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli.</a> DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).</li><li>Heinz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+features+in+the+structure,+mechanism,+and+biogenesis+of+the+inverse+autotransporter+protein+family.">Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family.</a> Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).</li><li>Selkrig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+an+archetypal+protein+transport+system+in+bacterial+outer+membranes.">Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).</li><li>Stubenrauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+assembly+of+fimbriae+in+Escherichia+coli+depends+on+the+translocation+assembly+module+nanomachine.">Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).</li><li>Leo, J. C., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunoglobulin-binding+Eib+proteins+from+Escherichia+coli+are+receptors+for+IgG+Fc.">The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).</li><li>M&#252;hlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Sch&#252;tz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+adhesin+A+(YadA)+-+Beauty+&amp;+beast.">Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty &amp; beast.</a> International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).</li><li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes.">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).</li><li>Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strain+collection+for+improved+expression+of+outer+membrane+proteins.">A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li><li>Grosskinsky, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+glycine+residue+of+trimeric+autotransporter+domains+plays+a+key+role+in+Yersinia+adhesin+A+autotransport.">A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport.</a> Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).</li><li>Leo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+E.+coli+IgG-binding+protein+D+suggests+a+general+model+for+bending+and+binding+in+trimeric+autotransporter+adhesins.">The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins.</a> Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+lysogenesis.+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Escherichia+coli.">Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+outer+membrane+insertion+and+folding+of+multimeric+transmembrane+&#946;-barrel+proteins.">Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane &#946;-barrel proteins.</a> Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).</li><li>Mikula, K. M., Leo, J. C., &#321;yskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translocation+domain+in+trimeric+autotransporter+adhesins+is+necessary+and+sufficient+for+trimerization+and+autotransportation.">The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation.</a> Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).</li><li>Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+genome+manipulation+by+P1+transduction.">E. coli genome manipulation by P1 transduction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).</li><li>Franklin, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+gal+U+gene+of+E.+coli+blocks+phage+P1+infection.">Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection.</a> Virology. 38 (1), 189-191 (1969).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequences+of+Escherichia+coli+B+strains+REL606+and+BL21(DE3).">Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3).</a> Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).</li><li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Alignment+during+Homologous+Recombination.">DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).</li><li>Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology+requirements+for+recombination+in+Escherichia+coli.">Homology requirements for recombination in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).</li><li>Ho, T. D., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7+gal+mutants+are+sensitive+to+bacteriophage+P1+and+defective+in+intestinal+colonization.">Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).</li><li>Ikeda, H., Tomizawa, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducing+fragments+in+generalized+transduction+by+phage+P1.+I.+Molecular+origin+of+the+fragments.">Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments.</a> Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).</li><li>Murooka, Y., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+host+range+of+coliphage+P1+and+gene+transfer+from+enteric+bacteria+to+other+Gam-negative+bacteria.">Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).</li><li>Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+selection+for+P1-sensitive+mutants+of+enteric+bacteria.">Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).</li><li>O'Connor, K. A., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coliphage+P1-mediated+transduction+of+cloned+DNA+from+Escherichia+coli+to+Myxococcus+xanthus:+use+for+complementation+and+recombinational+analyses.">Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses.</a> Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

P1 iletim gen silme E. coliüretmek için hızlı, sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Bu burada bir BL21 elde edilen alıcıya Keio donör zorlanma tamA silme mutant transducing tarafından gösterilmiştir. İletim işlemi büyük aşamasında bulunmaktadır lysate transducing üretim, iletim, Kan direnç kaset eksizyon ve knock-out PCR tarafından doğrulanması. Toplamda, süreci yaklaşık 1 hafta alır ve doğrulama için son PCR dışında kullanılmak üzere hiçbir moleküler biyoloji yöntem...

İşlev bir çalışmaya ortak bir ilk yaklaşım knock-out mutagenesis gerçekleştirmek ve elde edilen fenotip dikkat etmektir. Bu da geriye doğru genetik olarak adlandırılır. E. coli bakteri moleküler biyoloji beygir son 70 yıl ya da çok, kendi kültür ve onun amenability genetik manipülasyon1kolaylığı nedeniyle olmuştur. E. coliişaret exchange mutagenesis2,3 ve son zamanlarda, λ kırmızı veya Rac ET sistemleri4,5 kullanarak recombineering da dahil olmak üzere, gen silme üretmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir , 6.
Yaygın olarak kullanılan bir sistemde, bireysel genlerin kodlama dizileri daha sonra kromozom5,7' den eksize bir antibiyotik direnci kaset değiştirilir. Kodlama dizileri, hangi flippase (FLP) tanıma hedef (FRT) siteleri iki tarafında çevrili örneğin bir sefaloridin (Kan) direnç kaset, değiştirilir. FRT siteleri recombinase siteye özgü rekombinasyon Kan kaset silinmesi için önde gelen FRT siteler arasında aracılık eder FLP tarafından tanınır. Bu şekilde, belirli bir genin kodlama dizisi tam bir silme, yalnızca yaklaşık 100 baz çifti (bp) (resim 1) en az yara dizisi bırakarak elde edilebilir.
Sadece bir on yıl kadar önce sözde Keio koleksiyonu geliştirilmiştir. Bu nerede hemen hemen tüm gerekli olmayan genler ayrı ayrı λ kırmızı rekombinasyon7,8tarafından silindi Standart laboratuvar E. coli K12 zorlanma, temel bakteriyel bir kütüphanedir. Klonlar bu koleksiyon içindeki bir excisable Kan direnç kaset ile yerine bir kodlama dizisi var. Keio koleksiyon birçok uygulamaları9için yararlı bir araç olduğu ispatlanmıştır. Böyle bir uygulama diğer E. coli suşları silme mutantlar yapımıdır. Kan kaset üzerinden verilen silme klon genellikle bacteriophages, P110,11,12,13,14gibi transducing tarafından seferber. Böyle bir yük hazırlanan bir fajının hisse senedi daha sonra alıcı faiz, e.coli suşu bulaştırmak için nerede bir düşük ama güvenilir frekansta Kan kaset içeren bölge alıcı Genom tarafından Homolog rekombinasyon dahil edilebilir kullanılabilir (Şekil 2). Transductants Kan içeren ortamda büyümesi için seçilebilir. Antibiyotik direnci kaset kaldırılmasını isterseniz, bunu, FLP recombinase trans transductant zorlanma sağlanabilir. Ampisilin (Amp) direnç işaret taşıyan FLP içeren plazmid kür sonra Kan ve Amp duyarlı klonlar için ekranlı ve vahşi-türü kodlama dizisi ve Kan kaset doğru eksizyon PCR colony tarafından doğrulandı.
Burada, her bir knock-out yukarıda özetlenen strateji dayalı E. coli zorlanma üreten adımları açıklayan ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Örnek olarak, tamA gen silinmesiyle gösterilmiştir. tamA bir parçası olan taşıma ve montaj modülü (TAM), bazı autotransporter proteinler ve pili15,16,17Biyogenez yer bir dış membran β-varil protein kodlar. Bu knock-out zorlanma sonra iki trimeric autotransporter adhesins (TAAs), Yersinia adhesin YadA ve E. coli immünglobulin (Ig) tamA silinmesi Biyogenez üzerinde etkisini incelemek için kullanılan-TAA EibD bağlama 18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BW25113</td>
			<td>NIG</td>
			<td>ME6092</td>
			<td>Wild-type strain of Keio collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>69450-3</td>
			<td>Expression strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21DABCF</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>102270</td>
			<td>Derived from BL21(DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli JW4179</td>
			<td>NIG</td>
			<td>JW4179-KC</td>
			<td>tamA deletion mutant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1 vir</td>
			<td>NIG</td>
			<td>HR16</td>
			<td>Generally transducing bacteriophage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCP20</td>
			<td>CGSC</td>
			<td>14177</td>
			<td>conditionally replicating plasmid with FLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pASK-IBA2</td>
			<td>IBA GmbH</td>
			<td>2-1301-000</td>
			<td>expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEibD10</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for production of EibD; plasmid available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET22b+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>69744-3</td>
			<td>expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIBA2-YadA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for production of YadA; plasmid available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab145350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type I antibody COL-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine collagen type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA dye</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA molecular size marker</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3232S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL HRP substrate</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS10668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl thiogalactoside</td>
			<td>VWR</td>
			<td>43714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-lauroyl sarcosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamA forward primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence 5&#39;-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamA reverse primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence 5&#39;-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SUB13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FP120A-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>4000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation unit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>GP-03LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubating shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>CM1099A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Tpersonal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>HI2211-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAG electrophoresis chamber</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>D3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet transfer unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>TE22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes

Bakterilerde bilinmeyen bir gen işlevini incelemek için bir ilk yaklaşım bir knock-out bu gen oluşturmaktır. Burada, bakteriyofaj P1 ile jeneralize iletim kullanarak gen silme mutasyonlar bir Escherichia coli zorlanma diğerine aktarmak için sağlam ve hızlı bir iletişim kuralı açıklar. Bu yöntem mutasyon (antibiyotik kaset eklemeleri kullanarak gen kesintileri göre seçilebilirÖrneğin, ) olmasını gerektirir. Bu tür antibiyotik kaset bir donör yük seferber ve hızlı bir şekilde ilgi alıcı bir gerilim girmiştir ve kolayca bir gen silme mutant oluşturmak. Antibiyotik kaset kaset eksizyon izin flippase tanıma siteleri dahil etmek için temiz bir knock-out ile genom bir ~ 100 baz çifti uzun yara sırasına üretmek için siteye özgü bir recombinase tarafından dizayn edilebilir. Protokol autotransporter Biyogenez ilgili bir derleme faktör kodlama tamA gene dışarı knocking göstermek ve bu knock-out Biyogenez üzerinde etkisi ve iki trimeric autotransporter adhesins fonksiyonu test. Gen silme P1 iletim sınırlamaları olsa, kolaylık ve hız onun uygulama gene silme işlemini diğer yöntemleri için cazip bir alternatif olun.

Bir tamA Knock-out BL21ΔABCF, nesil:
Yukarıda özetlenen strateji BL21(DE3), dış membran protein üretimi için en iyi duruma getirilmiş ve BL21ΔABCF21denilen protein üretimi için kullanılan bir Standart laboratuvar yük türetilmiş bir tür üretmek için daha önce kullanılmış. Bu zorlanma dört genler bol dış membran proteinlerinin için kodlama yoksun ve sonuç olarak, daha hetero...

Watch this Scientific Journal Video about Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes at JoVE.com

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Escherichia coli Excisable antibiyotik direnci kasetleri ile P1 iletim tarafından üreten gen silme

Burada bir protokol antibiyotik direnç-kaset silme yapıları silme mutantlar diğer E. coli suşları yapmak için bir temel olarak önceden var olan kullanım için mevcut. Böyle silme mutasyonlar seferber ve büyük bir alıcı yük P1 bakteriyofaj iletim kullanarak odağı karşılık gelen eklenmiş.

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

producing-gene-deletions-escherichia-coli-p1-transduction-with

Research

JoVE Journal

Genetics

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

16.9K Görüntüleme.  University of Oslo. Burada bir protokol antibiyotik direnç-kaset silme yapıları silme mutantlar diğer E. coli suşları yapmak için bir temel olarak önceden var olan kullanım için mevcut. Böyle silme mutasyonlar seferber ve büyük bir alıcı yük P1 bakteriyofaj iletim kullanarak odağı karşılık gelen eklenmiş.

Video: Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Genetik

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için<emToksoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

Multicopy plazmid rolü antibiyotik direnci gelişimi test

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

Klinik kohort çalışmaları çoğaltılmış Genotipleme ve kütle spektrometresi ile test aday gen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

Deneysel Evrim Yaklaşımında Plazmid Aracılı Antibiyotik Direncinin Ölçülmesi

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Escherichia coli Excisable antibiyotik direnci kasetleri ile P1 iletim tarafından üreten gen silme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,

QTL Haritalama ve CRISPR / Cas9 Düzenlemesi, bir İlaç Direnç Geninin Belirlenmesi için