Keio-Sammlung-Sorten stammen aus dem nationalen BioResource Projekt (NIG, Japan): E. Coli. Wir danken Dirk Linke (Institut für Biowissenschaften, Universität Oslo) für seine kontinuierliche Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch den Forschungsrat von Norwegen Young Researcher Grant 249793 (zu Jack C. Leo) finanziert.

(1) Stämme und Plasmide
<ol><li>
Bakterienstämme
	<ol>
<li>Verwenden Sie die E. Coli -Stämme BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7BL21(DE3)20und BL21ΔABCF21. Weitere Informationen finden Sie in der Tabelle der Materialien .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bakteriophagen
	<ol>
<li>Die allgemeine Transduktion Phage P1Vir dient. Das Bakterium als eine Flüssigkeit Lager mit ein paar Tropfen Chloroform zu speichern (siehe Punkt 2.2). Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plasmide
	<ol>
<li>Verwenden Sie die folgenden Plasmide in diesem Protokoll: pCP2022, pIBA2-YadA23und pEibD1024. Verwenden Sie als Kontrolle Plasmide pASK-IBA2 und pET22b (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Wachstumsbedingungen
	<ol>
<li>Bakterien in einer Lysogeny Brühe (LB) mittlere25 mit kräftig schütteln (180 – 200 u/min) bei 37 ° C oder 30 ° C im Falle von BL21ΔABCF und Stämme mit pCP20 zu verbreiten.</li>
		<li>Führen Sie Plasmid Härtung bei 43 ° C.</li>
		<li>Für ein solides Medium LB mit 1 % Agar (w/V) zu ergänzen.</li>
		<li>Für obere Agar LB mit 0,7 % Agar und 10 mM CaCl2 und Autoklaven das Medium zu ergänzen. Verwenden Sie SOC-Medium für die Erholung nach Electroporation26.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgenden Konzentrationen für Antibiotika: 100 μg/mL für Amp und 25 μg/mL für Kan</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung einer Phagen Lysate
<ol><li>
Infektion des Spenders Stamm
	<ol>
<li>Wachsen die Spender-Stamm JW4197 in 5 mL LB-Medium ergänzt mit 10 mM CaCl2 und optional mit Kan (25 µg/mL) zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) ~ 1.0. Messen Sie OD600 Wert mit einem Spektralphotometer.</li>
		<li>Machen Sie eine Verdünnungsreihe von einer vorhandenen P1 Phage bestand in der LB-Medium: Empfohlene Verdünnungen sind zwischen 10-3 bis 10-7.</li>
		<li>Mix 200 μL der Bakteriensuspension und 100 μl einer bestimmten Phagen-Verdünnung in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen oder ähnlichem. Bereiten Sie so viele Rohre als Phagen Verdünnungen. Inkubieren Sie die Rohre für 20 min bei 37 ° C ohne schütteln.</li>
		<li>Fügen Sie hinzu ~ 3 mL geschmolzene obere Agar (~ 50 ° C) ergänzt mit 10 mM CaCl2 an den Rohren, mischen Sie die Inhalte durch aufschütteln der Rohre kurz und Gießen Sie die Mischungen auf vorgewärmte Teller der LB auch Schichten zu machen.</li>
		<li>Die Platten über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysate Vorbereitung
	<ol>
<li>Am nächsten Tag wählen Sie einen Teller mit einem semi-konfluierende Wachstum von Phagen Plaques. Auf einem semi-konfluierende Teller, etwa die Hälfte die Fläche der Platte ist klar (Abbildung 3).</li>
		<li>Kratzen Sie die obere Agar-Schicht aus solch einer Platte mit einem Impfschlinge oder einem ähnlichen Werkzeug und legen Sie die obere Agar in ein Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 1 – 2 mL LB und einen Tropfen Chloroform und Vortex Rohr energisch für ~ 1 min. hinzufügen das Chloroform in einer Dampfhaube.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Rohr für 15 min bei 4.000 x g oder schneller zu Agar und Bakterienzellen Pellets.</li>
		<li>Bewegen Sie den überstand zu einem frischen Microcentrifuge Schlauch, Vermeidung von jeglichen Schmutz von der Pellet Übertrag. 2 Tropfen Chloroform und speichern Sie die lysate bei 4 – 10 ° C. Chloroform in einer Dampfhaube hinzufügen. Nicht Einfrieren der Phagen lysate da dies zu einer deutlichen Verringerung der Zahl der infektiöse Partikel führt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bestimmung der lysate titer
	<ol>
<li>Wachsen Sie BW25113 in LB ergänzt mit 10 mM CaCl2 bei 37 ° C, bis die Kultur eines OD600 ~ 1,0 erreicht.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von den Phagen lysate in LB (z.B. 10-6– 10-9). Hinweis: Seien Sie vorsichtig, pipettieren der Probe vom oberen Rand der lysate zu vermeiden Übertragung von Chloroform auf die Verdünnungen.</li>
		<li>Mix 200 μL der Bakteriensuspension und 100 μl einer bestimmten Phagen-Verdünnung in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen oder ähnlichem. Bereiten Sie so viele Rohre als Phagen Verdünnungen. Inkubieren Sie die Rohre für 20 min bei 37 ° C ohne schütteln.</li>
		<li>Fügen Sie hinzu ~ 3 mL geschmolzene obere Agar (~ 50 ° C) ergänzt mit 10 mM CaCl2 an den Rohren, mischen Sie die Inhalte durch aufschütteln der Rohre kurz und Gießen Sie die Mischung auf vorgewärmte Teller der LB auch Schichten zu machen.</li>
		<li>Die Platten über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Am nächsten Tag die Anzahl der Plaketten (klare Regionen in die bakterienmatte) für jede Platte und der Titer von lysate mithilfe der folgenden Formel berechnen: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg"> Beispiel: Auf Tellern mit Verdünnungen 10-710-8und 10-9gibt es 231, 27 und 2 Plaketten, beziehungsweise. Als 100 μL jeder Verdünnung für die Infektion verwendet wurde, und weil der Titer als Plaque-Bildung zum Ausdruck kommt (Pfu) Einheiten / mL, die Beschichtung Faktor ist 10. Diese Zahlen werden in die Formel eingegeben: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg"> Der Titer ist also ca. 2 x 1010 infektiösen Phagen Partikel/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) P1 Transduktion
<ol><li>
Vorbereitung der empfängerzellen
	<ol>
<li>Wachsen die Empfänger Dehnung BL21ΔABCF in LB ergänzt zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) ~ 1.0. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um OD600 Wert zu messen.</li>
		<li>Berechnen Sie das Volumen der lysate Phagen notwendig, um eine Vielzahl von Infektionen (MOI) Wert von 0,5 zu erreichen. Um das MOI zu berechnen, schätzen Sie die Zahl der Bakterien, die basierend auf der OD600 der Kultur. Davon gehen Sie aus, dass ein OD-600 -Wert von 1,0 bis ~ 109 KBE/mL entspricht. Berechnen Sie das Volumen erforderlich, basierend auf der bekannten Titer von der lysate. Beispiel (basierend auf den Titer im Beispiel nach Schritt 2.3.6 berechnet): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg">
</li>
		<li>Die Empfänger-Stamm-Kultur bis 10 mM CaCl2 hinzufügen und mischen. 1 mL der Kultur für die Transduktion einnehmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Durchführung von Transduktion
	<ol>
<li>1 mL der Empfänger Kultur (einschließlich CaCl2 bei 10 mM) wie in Schritt 3.1.2 berechnet das entsprechende Volumen der Phagen lysate hinzufügen und vorsichtig mischen. Hinweis: Achten Sie auf die Probe von der Spitze des lysate zu vermeiden Übertragung von Chloroform zur Mischung pipette.</li>
		<li>Statisch inkubieren Sie die Mischung für 20 Minuten bei 37 ° c</li>
		<li>Stoppen Sie die Infektion durch Zugabe von Natriumcitrat, pH-Wert 5,5, bis 100 mM.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Bakterien (5.000 X g für 2 min) und entfernen Sie den überstand zu, dann Aufschwemmen Sie ihnen in 1 mL frisches LB ergänzt mit 100 mM Natrium-Citrat, pH 5,5.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mehr, wie in Schritt 3.2.4 um die Entfernung von freien Phagen und Kalzium zu gewährleisten.</li>
		<li>Aufzuwirbeln Sie die Bakterien in 1 mL frisches LB ergänzt mit 100 mM Natrium-Citrat, pH 5,5. Inkubieren Sie die Bakterien bei 30 ° C für 1 h unter Schütteln (> 100 u/min).</li>
		<li>Sammeln Sie die Bakterien durch Zentrifugieren (5.000 X g für 2 min) und Aufschwemmen sie in ~ 100 μL lb mit 100 mM Natrium-Citrat, pH 5,5.</li>
		<li>Verteilt die Bakterien auf eine LB-Platte mit Kan bei 25 µg/mL und 10 mM Natrium-Citrat, pH-Wert 5,5, ergänzt und wachsen die Bakterien bei 30 ° C bis Kolonien (~ 24 h) angezeigt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Auswahl der transductants
	<ol>
<li>Wenn Kolonien auf der Platte Auswahl gewachsen sind, restreak sie auf LB + Kan für einzelne Kolonien und wachsen bei 30 ° C, bis einzelne Kolonien erscheinen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) besteuert die Kan-Kassette
<ol><li>
Die Transformation mit Rekombination plasmid
	<ol>
<li>Die Kan-resistente BL21ΔABCF Stamm Electrocompetent zu machen.<ol>
<li>Wachsen die Belastung aus einer einzigen Kolonie in frisches LB (5 mL) ergänzt mit Kan (25 µg/mL) bei 30 ° C bis die OD600 ~0.5 – 0,7 ist.</li>
			<li>Führen Sie von hier aus die folgenden Schritte bei 4 ° C oder auf Eis. Zentrifugieren Sie die Bakterien (5.000 X g für 10 min) und entfernen Sie den überstand zu.</li>
			<li>Waschen Sie die Zelle Pellet mit eiskaltem destilliertes Wasser zweimal durch die Wiederholung der vorangegangenen Zentrifugationsschritt und schließlich Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 100 µL der eiskalte 10 % Glycerin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 mm Elektroporation Küvetten auf Eis abkühlen.</li>
		<li>Die Zellsuspension 1 Pg von Plasmid DNA (pCP20) hinzu, mischen Sie die Aussetzung vorsichtig, und übertragen Sie es auf einem gekühlten Elektroporation-Küvette.</li>
		<li>Legen Sie die Electroporator auf 1,8 kV und Electroporate der Zellen.</li>
		<li>Entartete Zellen zu retten, indem hinzufügen 1 mL SOC-Medium und wachsen zu lassen für 1 h bei 30 ° C.</li>
		<li>100 µL der Zellen auf LB-Platte + Amp-Platten und die Zellen bei 30 ° C über Nacht wachsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induktion von der Rekombination
	<ol>
<li>Wählen Sie einzelne Kolonien aus dem LB + Amp Platte und frisches LB weglassen aller Antibiotika zu impfen.</li>
		<li>Wachsen Sie die Zellen bei der non-permissive Temperatur (43 ° C) induzieren die Expression von FLP Rekombinase über Nacht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Auswahl recombinants
	<ol>
<li>Verdünnungsreihen und 50 µL einer 105-106 Verdünnung auf nicht-selektiven Platten Teller und wachsen sie über Nacht bei 30 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Überprüfung der Gen-Löschung
<ol><li>
Überprüfung der Plasmid-Verlust und erfolgreiche Rekombination
	<ol>
<li>Ader einzelne Kolonien von den Platten, die in Schritt 4.3.1 auf Kan, LB, LB + Amp vorbereitet und LB-Platten ohne Antibiotika, in dieser Reihenfolge. Um die Streifen zu erleichtern, verwenden Sie ein Kolonie-Raster (siehe ergänzende Datei 1). Wachsen Sie die Platten bei 30 ° C bis Kolonien (~ 24 h) angezeigt werden.</li>
		<li>Wählen Sie 10 – 20 Klone, die auf die nicht-selektiven Platte gewachsen, aber nicht auf selektivmedien zur weiteren Überprüfung zu wachsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zusätzliche Überprüfung von Colony PCR
	<ol>
<li>Führen Sie eine Kolonie PCR mit Primer flankieren das TamA Codierung Sequenz (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Bereiten Sie einen master PCR-Mix. Die Menge der Mischung benötigt hängt von der Anzahl der Kolonien getestet werden (siehe Beispiel in Tabelle 1). Mischen der Reagenzien auf Eis, fügen Sie die Polymerase zuletzt.</li>
		<li>Die PCR-master-Mix gründlich mischen, dann 20 µL in Röhren von einem PCR-Streifen zu verzichten. Wählen Sie eine kleine Menge von jeder Kolonie untersucht werden, mit einer sterilen Pipettenspitze und fügen Sie es zu einem Schlauch. Denken Sie daran, die ursprünglichen Empfänger Stamm zum Vergleich. Optional auch die Spender-Belastung.</li>
		<li>Ausführen eine PCR-Reaktion (siehe Tabelle 2 für das Programm verwendet).</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1 % Agarosegel.<ol>
<li>Messen Sie für eine 50 mL Gel 0,5 g Agarose zu und 50 mL TAE Puffer (40 mM Tris, Essigsäure 20 mM und 1 mM EDTA, pH 8,0). Erhitzen Sie die Mischung in einem Mikrowellenherd, bis alle Agarose gelöst hat.</li>
			<li>Sobald die Agarose gelöst hat, Abkühlen der Lösung auf etwa 50 ° C, und fügen Sie 5 μl DNA-Farbstoff Färbung. Mischen Sie die Lösung gut und Gießen Sie sie in ein Gel-Tablett in einer Casting-Kammer. Fügen Sie eine oder mehrere Zeilen von gut Kämmen, sodass gibt es genügende Brunnen für alle Proben sowie molekulare Größe Marker. Lassen Sie das Gel für 30 min eingestellt.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sobald der PCR-Lauf abgeschlossen ist, fügen Sie 4 µL 6 x DNA Loading Dye zu jeder Probe. Legen Sie das Gel in der Elektrophorese-Kammer und fügen Sie TAE Puffer hinzu, bis der Brunnen abgedeckt sind.</li>
		<li>10 – 15 µL jeder PCR-Reaktion zu einem Brunnen im Gel anwenden. Auch 5 µL einer Molekülgröße Markierung hinzufügen. Führen Sie dann das Gel für 30 min bei 75 V.</li>
		<li>Sobald das abgeschlossen ist, Bild, das Gel mit einem Blaulicht-Imager.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. sonstige Techniken
<ol><li>
Protein-expression Hinweis: Die Expression von Proteinen Test (YadA und EibD) wurde23,24an anderer Stelle ausführlich beschrieben. Dies ist eine kurze Zusammenfassung der wichtigsten Schritte.<ol>
<li>Verwandeln Sie BL21ΔABCF ΔTamA wIth die erforderlichen Plasmide (pIBA2-YadA und pEibD10 und die entsprechende Kontrolle Plasmide) zu, und wählen Sie für transformanten auf LB + Amp.</li>
		<li>Für die Proteinexpression 100 mL LB-Medium + Amp mit 1 mL einer Übernacht-Kultur transformierte Bakterien zu impfen und diese bei 30 ° C bis Mitte Log-Phase, zu welchem Zeitpunkt wachsen, induzieren die Proteinproduktion mit entweder Anhydrotetracycline (bei 100 ng/mL) oder Isopropyl Thiogalactoside (bei 0,5 mM).</li>
		<li>Nach 2 h der Induktion bei 30 ° C, Messung die Trübung der Kulturen und sammeln Sie eine Anzahl von Zellen entspricht 50 mL bei OD600 = 1.0 durch die Kulturen für 15 min bei 4.000 X gZentrifugieren. Waschen Sie die Tablette 1 X mit 10 mM HEPES, pH 7,4 und dann entweder speichern sie bei-20 ° C oder Verfahren sie weiter wie in Schritt 6.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Äußere Membran Extraktion Hinweis: Äußere Membran Extraktion erfolgt wie im Detail durch Leo Et Al. beschrieben 27. die wichtigsten Schritte sind im folgenden zusammengefasst.<ol>
<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL 10 mm HEPES, pH 7,4, ergänzt mit 10 mM MgCl2 , MnCl2, Lysozym (0,1 mg/mL) und einer Prise DNase ich.</li>
		<li>Lyse der Zellen (z.B.mit einem Wulst-Schläger).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen kurz (2 min bei 15.600 X g) um zellenrückstand zu entfernen und den überstand in ein frisches Tubus verschieben.</li>
		<li>Die Zellen für 30 min bei 16.000 X g, nach dem Zentrifugieren, das Pellet in 400 μl 1 % N-Lauroyl Sarkosin in 10 mM HEPES, pH 7.4 aufzuwirbeln.</li>
		<li>Inkubation der Zellen mit Agitation für 30 min bei Raumtemperatur, woraufhin, für 30 min wie oben beschrieben Zentrifugieren.</li>
		<li>Waschen der transluzenten pellet-1 X mit 200 μl 10 mm HEPES, pH 7,4, und dann in 30 μl 10 mm HEPES aufschwemmen und 10 μL von 4 x Probenpuffer SDS-PAGE hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aktivität-assays Hinweis: Führen Sie SDS-PAGE und Aktivität-Assays für YadA und EibD beschrieben28. Die wichtigsten Schritte sind im folgenden zusammengefasst.</li>
	<li>
SDS-PAGE
	<ol>
<li>Erhitzen Sie die Proben bei 50 ° C für 5 min vor dem Laden sie auf ein Polyacrylamid-Gel, um zu vermeiden, Denaturierung der Proteine.</li>
		<li>Übertragen Sie nach der Trennung im SDS-PAGE die Proteine auf einer Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran.</li>
		<li>Blockieren Sie nach der Übertragung die Membran mit 2 % Magermilchpulver in PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
YadA-Kollagen weit Western blot
	<ol>
<li>Fügen Sie nach der Sperrung bovinen Kollagen Typ hinzu, den ich verdünnt in blocking-Puffer zu einer Konzentration von 10 μg/mL und inkubieren Sie die Membran für 1 h.</li>
		<li>Waschen Sie die Membran 2 X mit PBS + 0,05 % Tween20 (PBS-T).</li>
		<li>Fügen Sie den primären Antikörper (monoklonalen Anti-Kollagen COL-1) an die Membran, verdünnte 1:2,000 in blocking-Puffer.</li>
		<li>Waschen Sie nach Bebrütung der Membran für 1 h 2 X, wie in Schritt 6.3.2.2 erwähnt und fügen Sie dann den Sekundärantikörper [Ziege Anti-Maus IgG-Meerrettich Peroxidase (HRP) Konjugat], verdünnt 1: 10.000 in blocking-Puffer.</li>
		<li>Die Membran für 1 h inkubieren, dann waschen Sie es 2 X mit PBS-T. Die Membran entsprechend den Anweisungen des Herstellers eine verstärkte Chemilumineszenz Substrat hinzu und erkennen Sie die Band mit einer CCD-Kamera zu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EibD-IgG Bindung Assay
	<ol>
<li>Fügen Sie nach der Sperrung ein sekundären Antikörper (Ziege Anti-Kaninchen HRP), 1:2,000 in blocking-Puffer verdünnt hinzu.</li>
		<li>Die Membran für 1 h inkubieren, dann waschen Sie es 2 X mit PBS. Führen Sie Chemolumineszenz Nachweis, wie im Schritt 6.3.2.5 erwähnt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blount, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unexhausted+potential+of+E.+coli.">The unexhausted potential of E. coli.</a> eLife. 4, e05826 (2015).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).</li><li>Link, A. J., Phillips, D., Church, G. 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C., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunoglobulin-binding+Eib+proteins+from+Escherichia+coli+are+receptors+for+IgG+Fc.">The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).</li><li>M&#252;hlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Sch&#252;tz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+adhesin+A+(YadA)+-+Beauty+&amp;+beast.">Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty &amp; beast.</a> International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).</li><li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes.">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).</li><li>Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strain+collection+for+improved+expression+of+outer+membrane+proteins.">A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li><li>Grosskinsky, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+glycine+residue+of+trimeric+autotransporter+domains+plays+a+key+role+in+Yersinia+adhesin+A+autotransport.">A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport.</a> Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).</li><li>Leo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+E.+coli+IgG-binding+protein+D+suggests+a+general+model+for+bending+and+binding+in+trimeric+autotransporter+adhesins.">The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins.</a> Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+lysogenesis.+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Escherichia+coli.">Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+outer+membrane+insertion+and+folding+of+multimeric+transmembrane+&#946;-barrel+proteins.">Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane &#946;-barrel proteins.</a> Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).</li><li>Mikula, K. M., Leo, J. C., &#321;yskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translocation+domain+in+trimeric+autotransporter+adhesins+is+necessary+and+sufficient+for+trimerization+and+autotransportation.">The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation.</a> Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).</li><li>Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+genome+manipulation+by+P1+transduction.">E. coli genome manipulation by P1 transduction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).</li><li>Franklin, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+gal+U+gene+of+E.+coli+blocks+phage+P1+infection.">Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection.</a> Virology. 38 (1), 189-191 (1969).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequences+of+Escherichia+coli+B+strains+REL606+and+BL21(DE3).">Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3).</a> Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).</li><li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Alignment+during+Homologous+Recombination.">DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).</li><li>Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology+requirements+for+recombination+in+Escherichia+coli.">Homology requirements for recombination in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).</li><li>Ho, T. D., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7+gal+mutants+are+sensitive+to+bacteriophage+P1+and+defective+in+intestinal+colonization.">Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).</li><li>Ikeda, H., Tomizawa, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducing+fragments+in+generalized+transduction+by+phage+P1.+I.+Molecular+origin+of+the+fragments.">Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments.</a> Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).</li><li>Murooka, Y., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+host+range+of+coliphage+P1+and+gene+transfer+from+enteric+bacteria+to+other+Gam-negative+bacteria.">Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).</li><li>Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+selection+for+P1-sensitive+mutants+of+enteric+bacteria.">Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).</li><li>O'Connor, K. A., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coliphage+P1-mediated+transduction+of+cloned+DNA+from+Escherichia+coli+to+Myxococcus+xanthus:+use+for+complementation+and+recombinational+analyses.">Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses.</a> Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

P1 Transduktion ist eine schnelle, robuste und zuverlässige Methode zur Erzeugung von Gen-Deletionen in E. Coli. Davon zeugt hier transducing einen TamA Löschung Mutant aus einem Keio-Spender-Stamm an einen Empfänger BL21 abgeleitet. Die wichtigsten Schritte bei der Transduktion sind die Herstellung von den transducing lysate, die Transduktion selbst, die Exzision der Kan-Widerstand-Kassette und die Überprüfung der Knock-out-mittels PCR. Insgesamt der Prozess dauert ca. 1 Woche und erfordert keine ...

Eine gemeinsame erste Annäherung an die Funktion eines Gens zu untersuchen ist, Knock-out-Mutagenese durchzuführen und die daraus resultierenden Phänotyp zu beobachten. Dies wird auch reverse Genetik bezeichnet. Das Bakterium E. Coli wurde das "Arbeitspferd" der molekularen Biologie für den letzten 70 Jahren oder so, wegen der Leichtigkeit seiner Kultivierung und seine Bereitschaft zur Genmanipulation1. Verschiedene Methoden wurden entwickelt, um gen Streichungen in E. Coli, einschließlich Marker Austausch Mutagenese2,3 und in jüngerer Zeit, Restriktionsenzymen mit dem λ rot oder Rac ET Systeme4,5 produzieren , 6.
In einem weit verbreiteten System werden kodierende Sequenzen einzelner Gene durch eine Antibiotika-Resistenz-Kassette ersetzt, die später von Chromosom5,7herausgeschnitten werden können. Die kodierenden Sequenzen werden, zum Beispiel durch eine Kanamycin (Kan) Widerstand Kassette ersetzt, die von Flippase (FLP) Anerkennung (FRT) Zielseiten auf beiden Seiten flankiert wird. Die FRT-Websites werden durch die Rekombinase FLP, erkannt die ortsspezifische Rekombination zwischen den FRT Standorten führt zur Löschung des Kan-Kassette vermittelt. Auf diese Weise kann eine vollständige Löschung der eines bestimmten Gens kodierende Sequenz erreicht werden, hinterlässt nur eine minimale Narbe Sequenz von etwa 100 Basenpaaren (bp) (Abbildung 1).
Etwas mehr als einem Jahrzehnt war die so genannte Keio-Kollektion entwickelt. Dies ist eine bakterielle Bibliothek basierend auf einem standardlabor E. Coli K12 Stamm, wo fast alle nicht-essentiellen Gene von λ rote Rekombination7,8einzeln gelöscht wurden. Die Klone in dieser Auflistung jedes haben eine kodierende Sequenz mit einer verbrauchsteuerpflichtigen Kan Widerstand Kassette ersetzt. Die Keio-Kollektion hat sich als ein nützliches Werkzeug für viele Anwendungen-9. Eine solche Anwendung ist die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Die Kan-Kassette aus einem gegebenen Löschung-Klon kann von in der Regel transducing Bakteriophagen, wie P110,11,12,13,14mobilisiert werden. Ein Phagen bestand aus ein solcher Stamm vorbereitet kann dann verwendet werden, einen Empfänger E. Coli -Stamm von Interesse, zu infizieren wo kann bei einer niedrigen, aber zuverlässige Frequenz der Kan Kassette-haltigen Region des Empfängers Genoms durch homologe Rekombination integriert werden (Abbildung 2). Transductants kann für das Wachstum auf dem Kan-haltigen Medium ausgewählt werden. Im Anschluss daran ggf. Entfernung der Antibiotika-Resistenz-Kassette die FLP-Rekombinase auf die Transductant Belastung in Trans lieferbar. Nach dem Aushärten der FLP-haltigen Plasmid, das welches eine Ampicillin (Amp) Widerstand Markierung trägt, Kan und Amp-sensitiven Klone sind geschirmt für, und die richtige Exzision der Wildtyp kodierende Sequenz und der Kan-Kassette werden durch Kolonie-PCR überprüft.
Hier ist ein detailliertes Protokoll präsentiert, die einzelnen Schritte bei der Herstellung eines Knock-out- E.-Coli -Stamm auf Basis der oben beschriebenen Strategie beschreiben. Als Beispiel wird eine Deletion des Gens TamA demonstriert. TamA kodiert eine äußere Membran β-Fass-Protein, die ist ein Teil von Transport und Montage-Modul (TAM), die in der Biogenese bestimmter Autotransporter Proteine und Pili15,16,17beteiligt ist. Verwendet wurde diese Knock-out-Stamm dann zu prüfen, die Wirkung der TamA -Löschung auf der Biogenese von zwei Trimere Autotransporter Adhesins (TAAs), Yersinia adhäsin YadA und E. Coli -Immunglobulin (Ig)-TAA EibD verbindlich 18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BW25113</td>
			<td>NIG</td>
			<td>ME6092</td>
			<td>Wild-type strain of Keio collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>69450-3</td>
			<td>Expression strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21DABCF</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>102270</td>
			<td>Derived from BL21(DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli JW4179</td>
			<td>NIG</td>
			<td>JW4179-KC</td>
			<td>tamA deletion mutant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1 vir</td>
			<td>NIG</td>
			<td>HR16</td>
			<td>Generally transducing bacteriophage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCP20</td>
			<td>CGSC</td>
			<td>14177</td>
			<td>conditionally replicating plasmid with FLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pASK-IBA2</td>
			<td>IBA GmbH</td>
			<td>2-1301-000</td>
			<td>expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEibD10</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for production of EibD; plasmid available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET22b+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>69744-3</td>
			<td>expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIBA2-YadA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for production of YadA; plasmid available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab145350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type I antibody COL-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine collagen type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA dye</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA molecular size marker</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3232S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL HRP substrate</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS10668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl thiogalactoside</td>
			<td>VWR</td>
			<td>43714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-lauroyl sarcosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamA forward primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence 5&#39;-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamA reverse primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence 5&#39;-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SUB13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FP120A-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>4000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation unit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>GP-03LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubating shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>CM1099A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Tpersonal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>HI2211-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAG electrophoresis chamber</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>D3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet transfer unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>TE22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes

Eine erste Annäherung an die Funktion eines unbekannten Gens in Bakterien zu untersuchen ist die Schaffung einen Knock-out-dieses Gens. Hier beschreiben wir eine robuste und schnelle Protokoll für die Übertragung von Genmutationen Löschung aus einem Escherichia-coli -Stamm zum anderen mithilfe von generalisierten Transduktion mit Bakteriophagen P1. Diese Methode erfordert, dass die Mutation wählbar (z. B. basierend auf Gen Störungen mit Antibiotika Kassette Insertionen). Solche Antibiotika Kassetten können aus einem Spender Stamm mobilisiert werden und führte zu einem Empfänger Stamm von Interesse schnell und einfach erzeugen eine gen-Löschung-Mutante. Die antibiotische Kassette kann soll Flippase Anerkennung Aufstellungsorte schließen, mit denen die Exzision der Kassette durch eine ortsspezifische Rekombinase einen sauberen Knock-out-mit nur einer ~ 100-Base-paar-lange Narbe-Sequenz des Genoms zu produzieren. Wir demonstrieren das Protokoll durch das TamA -gen Kodierung einen Montage-Faktor beteiligt Autotransporter Biogenese ausschlagen und testen Sie die Wirkung von diesem Knock-out auf der Biogenese und Funktion der beiden Trimere Autotransporter Adhesins. Obwohl gen Löschung durch P1 Transduktion seine Grenzen hat, machen die Leichtigkeit und Geschwindigkeit der Umsetzung es eine attraktive Alternative zu anderen Methoden der Gen-Löschung.

Generation ein TamA Knock Out des BL21ΔABCF:
Die oben dargelegte Strategie hat früher zu produzieren einen abgeleiteten Stamm von BL21(DE3), ein standard laborstamm verwendet für Protein-Produktion, die für die äußere Membran-Protein-Produktion optimiert und BL21ΔABCF21genannt. Diese Sorte fehlt vier Genen, die für reichlich äußere Membranproteine kodieren und deshalb in der Lage, mehr het...

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Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von bereits bestehenden antibiotische Resistenz-Kassette Löschung Konstrukte als Grundlage für die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Solche Löschung Mutationen können mobilisiert und in den entsprechenden Locus eines Empfängers Stamm mit P1 Bakteriophagen Transduktion eingefügt.

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

16.9K Aufrufe.  University of Oslo. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von bereits bestehenden antibiotische Resistenz-Kassette Löschung Konstrukte als Grundlage für die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Solche Löschung Mutationen können mobilisiert und in den entsprechenden Locus eines Empfängers Stamm mit P1 Bakteriophagen Transduktion eingefügt.

Serie: Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Forschung

Genetik

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation von einem Gen gestört Streptococcus Mutans Belastung ohne Gene Klonen

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

Kandidaten-Gen Tests in klinischen Kohortenstudien mit gemultiplexten Genotypisierung und Massenspektrometrie

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelte präzise Genbearbeitung durch Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

Quantifizierung der Plasmid-vermittelten Antibiotikaresistenz in einem experimentellen Evolutionsansatz

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...