케이오 컬렉션 긴장 국가 유관 프로젝트 (검, 일본)에서 가져온: 대장균. 그의 지속적인 지원에 감사 더크 맺고 (생물 과학 부, 오슬로 대학교) 하 고. 이 작품은 노르웨이 젊은 연구원 부여 249793 (잭 C. 레오)의 연구 위원회에 의해 투자 되었다.

1. 긴장 및 플라스 미드
<ol><li>
세균성 긴장
	<ol>
<li>E. 콜라이 긴장 BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7,20, BL21(DE3) 및 BL21ΔABCF21을 사용 합니다. 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
살 균 소
	<ol>
<li>P1비르 페이지를 사용 하 여 일반 변환에 대 한. 클로 프롬의 몇 방울과 액체 주식으로 페이지를 저장 (하십시오 단계 2.2 참조). 자세한 내용은 테이블의 자료를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
플라스 미드
	<ol>
<li>다음 플라스 미드를 사용 하 여이 프로토콜에: pCP2022,23, pIBA2 YadA pEibD1024. 제어 플라스 미드로 pASK-IBA2 및 pET22b ( 재료의 표참조)를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
성장 조건
	<ol>
<li>전파는 lysogeny 국물 (파운드) 중간25 활기찬 동요 (180-200 rpm) 37 ° C 또는 BL21ΔABCF 및 pCP20를 포함 하는 긴장의 경우 30 ° C에 있는 박테리아.</li>
		<li>43 ° c.에 치료 하는 플라스 미드를 수행</li>
		<li>단단한 매체에 대 한 1 %agar (w/v)와 파운드를 보충.</li>
		<li>최고 천 대 한 0.7 %agar 10mm CaCl2 와 압력솥 매체 LB 보충. Electroporation26후 회복 위한 SOC 매체를 사용 합니다.</li>
		<li>항생제에 대 한 다음 농도 사용: 100 μ g/mL로 앰프와 칸에 대 한 25 μ g/mL</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 준비 Lysate 살 균 소
<ol><li>
기증자 스트레인의 감염
	<ol>
<li>10 m m CaCl2 와 함께 선택적으로 칸을 보충 하는 파운드 매체의 5 mL에 기증자 스트레인 JW4197 성장 (25 µ g/mL) 600에서 광학 밀도를 ~ 1.0 nm (OD600). 분 광 광도 계를 사용 하 여 세600 값을 측정 합니다.</li>
		<li>LB 매체에는 기존 p 1 살 균 소 주식의 희석 시리즈를 만들기: 희석은 10-3 10-7을 권장.</li>
		<li>세균성 펜션과 15 mL 원심 분리기 관 또는 이와 동등한 주어진된 살 균 소 희석의 100 μ의 믹스 200 μ. 살 균 소 희석으로 많은 튜브를 준비 합니다. 동요 하지 않고 37 ° C에서 20 분 동안 튜브를 품 어.</li>
		<li>녹은 가기 천 (~ 50 ° C) 10mm CaCl2 관에 보충의 ~ 3 mL를 추가 하 고 내용을 철저 하 게 혼합 vortexing에 의해 관 곧, 심지어 레이어를 만들기 위해 prewarmed 파운드 접시에 혼합물을 부 어.</li>
		<li>37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysate 준비
	<ol>
<li>다음 날 살 균 소 패의 세미 confluent 성장과 플레이트를 선택 합니다. 약 절반의 표면적 접시 반 confluent 접시에 분명 하다 (그림 3).</li>
		<li>접종 루프 또는 비슷한 도구를 사용 하 여 같은 접시에서 최고 천 층을 긁어과 원심 분리기 튜브에 최고 agar를 놓습니다. 증기 두건에서 파운드의 1-2 mL 및 클로 프롬 및 소용돌이 적극적으로 ~ 1 분 추가 클로 프롬에 대 한 튜브의 한 방울을 추가 합니다.</li>
		<li>4000 g x 또는 더 작은 공의 천 및 세균성 세포에서 15 분 동안 튜브 원심</li>
		<li>신선한 microcentrifuge 튜브, 피하 펠 릿에서 어떤 파편 든 지 운반에 상쾌한을 이동 합니다. 클로 프롬의 2 방울을 추가 하 고 4-10 ° c.에 lysate 저장 증기 두건에서 클로 프롬을 추가 합니다. 마십시오 하지 고정 페이지 lysate로이 전염 성 입자 수의 뜻깊은 감소 귀 착될 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysate titer를 결정
	<ol>
<li>BW25113 LB 문화 OD600 ~ 1.0에 도달할 때까지 37 ° C에서 10 mM CaCl2 보충에서 성장.</li>
		<li>살 균 소 파운드 (예를 들어, 10-6– 10-9)에 lysate의 희석 시리즈 준비. 참고:은 희석을 클로 프롬을 전송 하지 않으려면 lysate의 위에서 피펫으로 샘플에 주의 해야 합니다.</li>
		<li>세균성 펜션과 15 mL 원심 분리기 관 또는 이와 동등한 주어진된 살 균 소 희석의 100 μ의 믹스 200 μ. 살 균 소 희석으로 많은 튜브를 준비 합니다. 동요 하지 않고 37 ° C에서 20 분 동안 튜브를 품 어.</li>
		<li>녹은 가기 천 (~ 50 ° C) 10mm CaCl2 관에 보충의 ~ 3 mL를 추가 하 고 내용을 철저 하 게 혼합 vortexing에 의해 관 곧, 심지어 레이어를 만들기 위해 prewarmed 파운드 접시에 혼합물을 부 어.</li>
		<li>37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어</li>
		<li>다음 날 플 라크 (세균성 매트에 명확한 지역) 각 접시의 수를 계산 하 고 다음 수식을 사용 하 lysate의 titer를 계산: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg"> 예: 접시 희석 10-7, 10-8및 10-9에 있다 231, 27, 2 패, 각각. 각 희석의 100 μ, 감염에 대 한 사용 되었습니다 그리고는 titer 플 라크 형성으로 표현 했기 때문에 단위 (pfu) / mL, 도금 요소는 10. 이 숫자를 수식에 입력 됩니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg"> 따라서,는 titer 약 2 × 1010 전염 성 살 균 소 입자/mL 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. P1 변환
<ol><li>
받는 사람 세포 준비
	<ol>
<li>받는 사람 변형 BL21ΔABCF 파운드 600에서 광학 밀도를 보충 성장 ~ 1.0 nm (OD600). OD600 값을 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다.</li>
		<li>0.5의 감염 (MOI) 값의 다양성을 달성 하는 데 필요한 페이지 lysate의 볼륨을 계산 합니다. 나를 계산 하려면 문화권의 OD600 에 따라 박테리아의 수를 견적 한다. OD600 값이 1.0 ~ 109 cfu/mL에 해당 하는 가정 합니다. lysate의 알려진된 titer에 따라 필요한 볼륨을 계산 합니다. 예 (titer 단계 2.3.6 후 예제에서 계산에 따라): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg">
</li>
		<li>10 m m 받는 사람 긴장 문화 CaCl2 를 추가 하 고 혼합. 변환에 대 한 문화의 1 mL를 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
변환 수행
	<ol>
<li>받는 사람 문화 (를 포함 하 여 10 m m CaCl2 ) 단계 3.1.2에서에서 계산한 1 mL를 파지 lysate의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 참고: 플라스틱 믹스에 클로 프롬을 전송 하지 않으려면 lysate의 상단에서 샘플을 주의 해야 합니다.</li>
		<li>정적으로 37 ° c.에 20 분을 위한 혼합을 품 어</li>
		<li>100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5 추가 하 여 감염을 중지 합니다.</li>
		<li>박테리아 (5000 x g 2 분) centrifuge 고 상쾌한, 다음 100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5로 보충 하는 신선한 파운드의 1 mL에 그들을 resuspend.</li>
		<li>세포 단계 무료 페이지 및 칼슘의 제거를 보장 하기 위해 3.2.4 에서처럼 두 번 더 씻는 다.</li>
		<li>100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5로 보충 하는 신선한 파운드의 1 mL에 박테리아 resuspend (> 100 rpm)를 흔들어 1 h 30 ° C에서 박테리아를 품 어.</li>
		<li>원심 (5000 x g 2 분)에 의해 박테리아를 수집 하 고 100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5와 파운드의 ~ 100 μ에 그들을 resuspend.</li>
		<li>25 µ g/mL와 10 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5에서 칸으로 보충 하는 파운드 플레이트에 박테리아를 확산 하 고 식민지 (~ 24 h)이 나타날 때까지 30 ° C에서 박테리아를 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
transductants를 선택 하면
	<ol>
<li>식민지는 선택 접시에 성장 했다, 일단 단일 식민지를 위한 파운드 + 칸에 그들을 restreak 단일 식민지 나타납니다까지 30 ° C에서 성장 하 고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 절 개 칸 카세트
<ol><li>
재조합 플라스 미드 전이
	<ol>
<li>관 저항 BL21ΔABCF 긴장 electrocompetent를 확인 합니다.<ol>
<li>신선한 파운드 (5 mL) 칸 보충에 단일 식민지에서 스트레인 성장 (25 µ g/mL) OD600 ~0.5-0.7까지 30 ° C에서.</li>
			<li>여기에서에, 다음 단계 또는 얼음에 4 ° C에서 실시 합니다. Centrifuge 박테리아 (5000 x g 10 분) 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
			<li>이전 원심 분리 단계를 반복 하 여 두 번 차가운 증류수와 셀 펠 릿을 세척 하 고, 마지막으로, 얼음 10% 글리세롤의 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1mm electroporation 큐 벳 얼음에 식혀.</li>
		<li>세포 현 탁 액을 플라스 미드 DNA (pCP20)의 1 세를 추가 하 고 부드럽게, 현 탁 액을 혼합 냉각된 electroporation 베트에 그것을 전송.</li>
		<li>1.8는 electroporator 설정 kV 및 electroporate 셀.</li>
		<li>SOC 매체의 1 mL을 추가 하 고 1 h 30 ° c.에 대 한 그들을 성장 하 여 변형 된 세포를 구출</li>
		<li>파운드에 셀의 100 µ L 플레이트 + 앰프 플레이트와 하룻밤 30 ° C에서 세포를 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재결합의 유도
	<ol>
<li>선택 단일 식민지 파운드 + 앰프에서 접시 하 고 접종 신선한 파운드 모든 항생제를 생략.</li>
		<li>FLP recombinase의 표현을 유도 하룻밤 비 허용 온도 (43 ° C)에서 세포 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recombinants 선택
	<ol>
<li>직렬 희석 하 고 만들고, 비 선택적 접시에 105-106 희석의 50 µ L 플레이트 하룻밤 30 ° c.에서 그것을 성장합니다</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. 유전자 삭제 확인
<ol><li>
플라스 미드 손실 및 성공적인 재결합의 확인
	<ol>
<li>격판덮개에서 행진 한 식민지 파운드 + 칸, 파운드 + 앰프, 그리고 파운드에 4.3.1 단계에서이 순서로 항생제 없이 접시 준비. 줄무늬에 투입, 식민지 표 사용 하 여 ( 보충 파일 1참조). 식민지 (~ 24 h)이 나타날 때까지 30 ° C에서 번호판을 성장.</li>
		<li>비 선택적 접시에 성장 하지만 추가 확인에 대 한 선택적 미디어에 성장 하지 못했습니다 10-20 클론을 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
식민지 PCR에 의해 추가 확인
	<ol>
<li>식민지 PCR 뇌관 순서 코딩 타 마 측면으로 수행 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>마스터 PCR 혼합을 준비 합니다. 필요 믹스 ( 표 1의 예를 참조) 테스트 하는 식민지의 수에 따라 다릅니다. 얼음에 시 약을 혼합, 마지막에 중 합 효소를 추가 합니다.</li>
		<li>철저 하 게, PCR 마스터 믹스를 섞어 다음 20 µ L를 PCR 스트립의 튜브로 분배. 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 상영 될 각 식민지의 작은 금액을 선택 하 고 튜브를 추가. 비교를 위해 원래 받는 사람 긴장을 포함 하도록 하십시오. 선택적으로, 기증자 스트레인 포함.</li>
		<li>PCR 반응 실행 (사용 하는 프로그램에 대 한 표 2 참조).</li>
		<li>1 %agarose 젤 준비.<ol>
<li>50ml 젤 agarose의 0.5 g을 측정 하 고 태 버퍼 (40 m m Tris, 20 mM 아세트산 그리고 1 mM EDTA, pH 8.0) 50 mL를 추가 합니다. 모든 agarose 해산 했다 때까지 렌지에 혼합물을 열.</li>
			<li>agarose 해산 했다, 일단 약 50 ° C에 대 한 해결책을 냉각 하 고 염료를 착 색 하는 DNA의 5 μ를 추가 합니다. 솔루션을 잘 혼합 하 고 주조 챔버에 젤 트레이에 부 어. 분자 크기 마커 뿐만 아니라 모든 샘플에 대 한 충분 한 웰 스는 잘 빗의 하나 이상의 행을 삽입 합니다. 30 분 설정 하 젤을 허용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR 실행 완료 되 면 각 샘플을 DNA 로드 염료 x 6의 4 µ L를 추가 합니다. 젤 전기 이동 법 챔버에 배치 하 고 우물 덮여 때까지 태 버퍼를 추가 합니다.</li>
		<li>젤에 잘 각 PCR 반응에서 10-15 µ L를 적용 합니다. 또한 분자 크기 마커의 5 µ L를 추가 합니다. 그런 다음 75 V에서 30 분 동안 젤을 실행 합니다.</li>
		<li>실행 완료 되 면 젤 블루 빛 영상 장치를 사용 하 여 이미지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 기타 기술
<ol><li>
단백질 표정 참고: 테스트 단백질 (YadA와 EibD)의 표현 되었습니다23,24다른 곳에서 상세히 설명. 이것은 주요 단계에 대 한 간단한 요약입니다.<ol>
<li>BL21ΔABCF Δ타 with 필요한 플라스 미드 (pIBA2-쫑 알, pEibD10 및 해당 제어 플라스 미드)를 변환 하 고 transformants 파운드 + 앰프에 대 한 선택.</li>
		<li>단백질 표정에 대 한 변형 된 박테리아의 숙박 문화의 1 mL와 함께 파운드 매체 + 앰프의 100 mL를 접종 하 고 30 ° C에서이 시간에 중간 로그 단계까지 성장, (100 ng/mL)에서 어느 anhydrotetracycline와 단백질 생산을 유도 하거나 이소프로필 thiogalactoside (0.5 m m).</li>
		<li>30 ° C에서 유도의 2 h 문화의 탁도 측정 하 고 OD600 에서 50 mL에 해당 하는 셀의 수를 수집 후 4000 x g에서 15 분 동안 문화 centrifuging 여 1.0 =. 펠 릿을 세척 1 x 10 mm HEPES, pH 7.4, 그리고 중-20 ° C 또는 프로세스 단계 6.2 에서처럼 추가 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
외부 막 추출 참고: 외부 막 추출 레오 외 에 의해 세부 사항에 설명 된 대로 수행 됩니다. 27. 주요 단계 아래 요약 되어 있습니다.<ol>
<li>10 mm HEPES, pH 7.4, resuspend 1 mL에 셀 펠 릿 10 mM MgCl2 , MnCl2, lysozyme (0.1 mg/mL), 및 DNase의 핀치 나 보충.</li>
		<li>(예를 들어, 구슬 때리는 사용 하 여) 셀 lyse</li>
		<li>세포 파편을 제거 하 고 신선한 튜브에는 상쾌한 이동 곧 셀 (15,600 x g2 분)을 원심.</li>
		<li>16000 x g에서 30 분 동안 셀 후 원심, 10 mM HEPES, pH 7.4에에서 1% N lauroyl sarcosine의 400 μ에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>실 온에서 30 분 동안 교 반 후 셀을 품 어, 위와 같이 30 분 동안 원심.</li>
		<li>세척은 반투명 1 x 10 mm HEPES, pH 7.4, 200 μ와 작은 10 mm HEPES 30 μ에 resuspend 그리고 SDS 페이지 샘플 버퍼 x 4의 10 μ를 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
활동 분석 실험 참고: 설명28YadA와 EibD에 대 한 SDS 페이지 및 활동 분석 실험을 수행 합니다. 주요 단계는 아래에 요약 된다.</li>
	<li>
SDS 페이지
	<ol>
<li>단백질을 변성 시키기 방지 하려면 polyacrylamide 젤에 그들을 로드 하기 전에 5 분 동안 50 ° C에서 샘플을 열.</li>
		<li>SDS 페이지에서 분리 후 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 단백질을 전송 합니다.</li>
		<li>송금 후 PBS에 2% 무 지방 우유 파우더 막을 차단 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
뭐라 나 콜라겐 멀리 서쪽 오 점
	<ol>
<li>차단, 후 10 μ g/mL의 농도에 블로킹 버퍼에 소 콜라겐 유형 나 희석을 추가 하 고 1 시간에 대 한 막 품 어.</li>
		<li>막 2 워시 x PBS + 0.05 %Tween20 (PBS-T).</li>
		<li>블로킹 버퍼에 막에 1 차적인 항 체 (단일 클로 널 항 콜라겐 COL-1), 희석된 1:2,000를 추가 합니다.</li>
		<li>잠복기 1 h 막, 후 6.3.2.2 단계에서 언급 한 대로 2 배를 세척 하 고 이차 항 체 [염소 반대로 마우스 IgG-양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 켤레], 희석된 1:10,000 블로킹 버퍼에 추가 합니다.</li>
		<li>1 시간에 대 한 막 품 어 다음 그것을 씻어 PBS. 2 x 향상 된 chemiluminescent 기판 제조업체의 지침에 따라 막에 추가 하 고 CCD 카메라를 사용 하 여 밴드를 감지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EibD IgG 바인딩 분석 결과
	<ol>
<li>차단, 이차 항 체 (염소 안티 토끼 HRP), 희석 1:2,000 블로킹 버퍼에 추가 합니다.</li>
		<li>1 시간에 대 한 막 품 어 다음 그것을 씻어 PBS 가진 2 x. 6.3.2.5 단계에서 언급 한 대로 chemiluminescent 감지를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blount, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unexhausted+potential+of+E.+coli.">The unexhausted potential of E. coli.</a> eLife. 4, e05826 (2015).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).</li><li>Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+precise+deletions+and+insertions+in+the+genome+of+wild-type+Escherichia+coli:+application+to+open+reading+frame+characterization.">Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization.</a> Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).</li><li>Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+in+vivo+genetic+engineering+in+E.+coli,+S.+enterica,+and+beyond.">Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond.</a> Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques:+Recombinogenic+engineering--new+options+for+cloning+and+manipulating+DNA.">Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+Keio+collection+of+Escherichia+coli+single-gene+deletion+mutants.">Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants.</a> Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).</li><li>Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+applications+of+systematic+in-frame,+single-gene+knockout+mutant+collection+of+Escherichia+coli+K-12.">The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12.</a> Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).</li><li>Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyamines+are+not+required+for+aerobic+growth+of+Escherichia+coli:+preparation+of+a+strain+with+deletions+in+all+of+the+genes+for+polyamine+biosynthesis.">Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).</li><li>Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+simvastatin+bioconversion+in+Escherichia+coli+by+deletion+of+bioH.">Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH.</a> Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).</li><li>Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+hydrogenase+3+is+a+reversible+enzyme+possessing+hydrogen+uptake+and+synthesis+activities.">Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).</li><li>Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disulfide+bond+formation+pathway+is+essential+for+anaerobic+growth+of+Escherichia+coli.">The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).</li><li>Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+approach+to+identify+the+genes+involved+in+biofilm+formation+in+E.+coli.">A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli.</a> DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).</li><li>Heinz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+features+in+the+structure,+mechanism,+and+biogenesis+of+the+inverse+autotransporter+protein+family.">Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family.</a> Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).</li><li>Selkrig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+an+archetypal+protein+transport+system+in+bacterial+outer+membranes.">Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).</li><li>Stubenrauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+assembly+of+fimbriae+in+Escherichia+coli+depends+on+the+translocation+assembly+module+nanomachine.">Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).</li><li>Leo, J. C., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunoglobulin-binding+Eib+proteins+from+Escherichia+coli+are+receptors+for+IgG+Fc.">The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).</li><li>M&#252;hlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Sch&#252;tz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+adhesin+A+(YadA)+-+Beauty+&amp;+beast.">Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty &amp; beast.</a> International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).</li><li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes.">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).</li><li>Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strain+collection+for+improved+expression+of+outer+membrane+proteins.">A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li><li>Grosskinsky, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+glycine+residue+of+trimeric+autotransporter+domains+plays+a+key+role+in+Yersinia+adhesin+A+autotransport.">A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport.</a> Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).</li><li>Leo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+E.+coli+IgG-binding+protein+D+suggests+a+general+model+for+bending+and+binding+in+trimeric+autotransporter+adhesins.">The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins.</a> Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+lysogenesis.+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Escherichia+coli.">Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+outer+membrane+insertion+and+folding+of+multimeric+transmembrane+&#946;-barrel+proteins.">Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane &#946;-barrel proteins.</a> Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).</li><li>Mikula, K. M., Leo, J. C., &#321;yskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translocation+domain+in+trimeric+autotransporter+adhesins+is+necessary+and+sufficient+for+trimerization+and+autotransportation.">The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation.</a> Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).</li><li>Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+genome+manipulation+by+P1+transduction.">E. coli genome manipulation by P1 transduction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).</li><li>Franklin, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+gal+U+gene+of+E.+coli+blocks+phage+P1+infection.">Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection.</a> Virology. 38 (1), 189-191 (1969).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequences+of+Escherichia+coli+B+strains+REL606+and+BL21(DE3).">Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3).</a> Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).</li><li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Alignment+during+Homologous+Recombination.">DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).</li><li>Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology+requirements+for+recombination+in+Escherichia+coli.">Homology requirements for recombination in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).</li><li>Ho, T. D., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7+gal+mutants+are+sensitive+to+bacteriophage+P1+and+defective+in+intestinal+colonization.">Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).</li><li>Ikeda, H., Tomizawa, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducing+fragments+in+generalized+transduction+by+phage+P1.+I.+Molecular+origin+of+the+fragments.">Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments.</a> Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).</li><li>Murooka, Y., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+host+range+of+coliphage+P1+and+gene+transfer+from+enteric+bacteria+to+other+Gam-negative+bacteria.">Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).</li><li>Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+selection+for+P1-sensitive+mutants+of+enteric+bacteria.">Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).</li><li>O'Connor, K. A., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coliphage+P1-mediated+transduction+of+cloned+DNA+from+Escherichia+coli+to+Myxococcus+xanthus:+use+for+complementation+and+recombinational+analyses.">Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses.</a> Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).</li></ol>

저자는 공개 없다.

P1 변환 대장균에 유전자 삭제를 생성 하기 위한 빠르고, 강력 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 여기 BL21 파생 된 받는 사람에 게 케이오 기증자 스트레인에서 타 마 삭제 돌연변이 시험에 의해 증명 됩니다. 변환 프로세스의 주요 단계는 lysate는 시험의 생산, 자체 변환, 칸 저항 카세트의 절단 및 PCR에 의해 녹아웃의 확인. 총에서 과정 약 1 주일 소요 하며 확인에 대 한 최종 PCR를 ?...

유전자의 기능 연구에 대 한 일반적인 첫 번째 접근 노크 아웃 mutagenesis 수행 결과 표현 형을 관찰 하는 것입니다. 이것은 또한 반전 유전학을 불린다. 지난 70 년 동안 또는 이렇게, 그것의 경작 및의 순종 유전자 조작1의 용이성으로 인해 박테리아 대장균 분자 생물학의 주력 하고있다. 여러 가지 방법은 대장균, 등 표식 exchange mutagenesis2,3 , 더 최근에, λ 레드 또는 Rac 외 시스템4,5 를 사용 하 여 recombineering에에서 유전자 삭제를 생산 하기 위해 개발 되었습니다. , 6.
널리 사용 되는 시스템에서 개별 유전자의 코딩 시퀀스에서 염색체5,7excised 나중 수는 항생제 저항 카세트로 대체 됩니다. 코딩 시퀀스 대체 된다, 예를 들어 대 (칸) 저항 카세트, 양쪽에 flippase (FLP) 인식 대상 (FRT) 사이트에 의해 형벌 이다. FRT 사이트 recombinase 칸 카세트의 삭제로 이어지는 FRT 사이트 간의 사이트 재결합 중재 FLP에 의해 인식 됩니다. 이 방법에서는, 주어진된 유전자의 코딩 시퀀스의 전체 삭제 얻을 수 있습니다, 약 100의 기본적인 쌍 (bp) (그림 1)의 순서만 최소한의 흉터를 남겨두고.
전 10 년 넘게 소위 게이오 컬렉션 개발 되었다. 이것은 세균성 라이브러리 기반 표준 실험실 대장균 K12 변형, 거의 모든 비-필수 유전자 λ 빨간 재결합7,8에 의해 개별적으로 삭제 되었습니다. 이 컬렉션에서 클론 excisable 칸 저항 카세트 교체의 코딩 시퀀스 한 개 있다. 케이오 컬렉션9많은 응용 프로그램 대 한 유용한 도구가 될 입증 되었습니다. 하나는 같은 응용 프로그램 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이의 생산 이다. 일반적으로 살 균 소, P110,11,12,,1314등을 시험 하 여 주어진된 삭제 복제에서 칸 카세트를 동원 수 있습니다. 살 균 소 주식 같은 긴장에서 준비 사용할 수 있습니다 받는 사람의, E. 콜라이 긴장을 감염 하 어디 낮은 하지만 신뢰할 수 있는 주파수는 칸에서 카세트 포함 된 지역 포함 될 수 있습니다 받는 사람 게놈으로 동종 재결합에 의해 (그림 2)입니다. Transductants 칸 포함 된 매체에 성장에 대 한 선택할 수 있습니다. 이 따라 항생제 저항 카세트의 제거를 원하는 경우 트랜스 transductant 변형에 FLP recombinase 공급 수 있다. FLP 포함 된 플라스 미드, 암 피 실린 (Amp) 저항 마커를 운반, 경화 후 칸와 앰프-민감한 클론에 대 한 검사는 하 고 야생-타입 코딩 순서와 칸 카세트의 정확한 절단 식민지 PCR에 의해 확인 됩니다.
여기, 상세한 프로토콜 제공 됩니다, 각 녹아웃 대장균 스트레인 위에서 설명한 전략에 따라 생산 단계를 설명 하. 예를 들어, 타 마 유전자의 삭제는 보여 줍니다. 타 마 일부 전송 및 어셈블리 모듈 (TAM), 특정 autotransporter 단백질 및 pili15,,1617의 속에 포함 되는 외부 막 β 배럴 단백질을 인코딩합니다. 이 노크 아웃 긴장은 다음 2 개의 trimeric autotransporter adhesins (다시), 페스트 adhesin YadA와 대장균 면역 글로불린 (Ig)는 속에 다 마 삭제의 효과 검사 하는 데 사용 됩니다-TAA EibD 바인딩 18,19.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BW25113</td>
			<td>NIG</td>
			<td>ME6092</td>
			<td>Wild-type strain of Keio collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>69450-3</td>
			<td>Expression strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21DABCF</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>102270</td>
			<td>Derived from BL21(DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli JW4179</td>
			<td>NIG</td>
			<td>JW4179-KC</td>
			<td>tamA deletion mutant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1 vir</td>
			<td>NIG</td>
			<td>HR16</td>
			<td>Generally transducing bacteriophage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCP20</td>
			<td>CGSC</td>
			<td>14177</td>
			<td>conditionally replicating plasmid with FLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pASK-IBA2</td>
			<td>IBA GmbH</td>
			<td>2-1301-000</td>
			<td>expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEibD10</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for production of EibD; plasmid available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET22b+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>69744-3</td>
			<td>expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIBA2-YadA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for production of YadA; plasmid available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab145350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type I antibody COL-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine collagen type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA dye</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA molecular size marker</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3232S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL HRP substrate</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS10668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl thiogalactoside</td>
			<td>VWR</td>
			<td>43714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-lauroyl sarcosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamA forward primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence 5&#39;-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamA reverse primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence 5&#39;-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SUB13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FP120A-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>4000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation unit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>GP-03LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubating shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>CM1099A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Tpersonal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>HI2211-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAG electrophoresis chamber</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>D3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet transfer unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>TE22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes

박테리아에서 알 수 없는 유전자의 기능 연구에 대 한 첫 번째 접근은이 유전자의 녹아웃을 만드는 것입니다. 여기, 우리는 강력 하 고 빠른 살 균 소 P1 일반화 된 변환 사용 하 여 다른 한 대장균 긴장에서 유전자 삭제 돌연변이 전송 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 돌연변이 선택 가능 (예: 항생제 카세트 삽입을 사용 하 여 유전자 중단에 따라) 해야 합니다. 이러한 항생제 카세트 기증자 긴장에서 동원 될 수 있습니다 관심 받는 사람 부담으로 신속 하 게 도입 하 고 쉽게 유전자 삭제 돌연변이 생성. 항생제 카세트 사이트별 recombinase 게놈에서 순서 ~ 100-기지-쌍-긴 흉터만 깨끗 한 녹아웃을 생산 하 여 카세트의 절단을 허용 하는 flippase 인식 사이트를 포함 하도록 디자인할 수 있습니다. 우리는 어셈블리 요소 autotransporter 속에 관련 된 인코딩 타 유전자를 노크 하 여 프로토콜을 설명 하 고는 속에이 노크 아웃의 효과 및 2 개의 trimeric autotransporter adhesins의 기능 테스트. P1 변환에 의해 유전자 삭제는 한계가, 비록 편리 하 고 속도 구현 하기가 유전자 삭제의 다른 방법에 매력적인 대안.

세대는 타 마 노크 아웃 BL21ΔABCF의의:
위에서 설명한 전략은 이전 BL21(DE3), 외부 막 단백질 생산을 위한 최적화 이며 BL21ΔABCF21라는 단백질 생산에 사용 되는 표준 실험실 긴장의 파생 긴장을 생산 하기 위해 사용 되었습니다. 이 긴장 풍부한 외부 막 단백질을 코딩 하는 4 개의 유전자를 부족 하 고, 따라서,...

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Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

여기 선물이 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이 만들기 위한 기반으로 기존의 항생제 저항-카세트 삭제 구문을 사용 하는 프로토콜. 이러한 삭제 돌연변이 동원 고 P1 살 균 소 변환을 사용 하 여 받는 사람 긴장의 해당 장소에 삽입 될 수 있습니다.

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

producing-gene-deletions-escherichia-coli-p1-transduction-with

Research

JoVE Journal

Genetics

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

16.9K 조회수.  University of Oslo. 여기 선물이 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이 만들기 위한 기반으로 기존의 항생제 저항-카세트 삭제 구문을 사용 하는 프로토콜. 이러한 삭제 돌연변이 동원 고 P1 살 균 소 변환을 사용 하 여 받는 사람 긴장의 해당 장소에 삽입 될 수 있습니다.

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Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

연구

유전학

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

약물 저항 유전자를 확인하기위한 QTL 매핑 및 CRISPR / Cas9 편집<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

유전자 교란 mutans 연쇄 상 구 균 긴장 없이 유전자 복제의 생성

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

실험적 진화 접근법에서 플라스미드 매개 항생제 내성의 정량화

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...