Name: producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes
Uploaded: 2018-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes at JoVE.com

케이오 컬렉션 긴장 국가 유관 프로젝트 (검, 일본)에서 가져온: 대장균. 그의 지속적인 지원에 감사 더크 맺고 (생물 과학 부, 오슬로 대학교) 하 고. 이 작품은 노르웨이 젊은 연구원 부여 249793 (잭 C. 레오)의 연구 위원회에 의해 투자 되었다.

1. 긴장 및 플라스 미드
<ol><li>
세균성 긴장
	<ol>
<li>E. 콜라이 긴장 BW251135, JW4179 (BW25113 tamA::kan)7,20, BL21(DE3) 및 BL21ΔABCF21을 사용 합니다. 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
살 균 소
	<ol>
<li>P1비르 페이지를 사용 하 여 일반 변환에 대 한. 클로 프롬의 몇 방울과 액체 주식으로 페이지를 저장 (하십시오 단계 2.2 참조). 자세한 내용은 테이블의 자료를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
플라스 미드
	<ol>
<li>다음 플라스 미드를 사용 하 여이 프로토콜에: pCP2022,23, pIBA2 YadA pEibD1024. 제어 플라스 미드로 pASK-IBA2 및 pET22b ( 재료의 표참조)를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
성장 조건
	<ol>
<li>전파는 lysogeny 국물 (파운드) 중간25 활기찬 동요 (180-200 rpm) 37 ° C 또는 BL21ΔABCF 및 pCP20를 포함 하는 긴장의 경우 30 ° C에 있는 박테리아.</li>
		<li>43 ° c.에 치료 하는 플라스 미드를 수행</li>
		<li>단단한 매체에 대 한 1 %agar (w/v)와 파운드를 보충.</li>
		<li>최고 천 대 한 0.7 %agar 10mm CaCl2 와 압력솥 매체 LB 보충. Electroporation26후 회복 위한 SOC 매체를 사용 합니다.</li>
		<li>항생제에 대 한 다음 농도 사용: 100 μ g/mL로 앰프와 칸에 대 한 25 μ g/mL</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 준비 Lysate 살 균 소
<ol><li>
기증자 스트레인의 감염
	<ol>
<li>10 m m CaCl2 와 함께 선택적으로 칸을 보충 하는 파운드 매체의 5 mL에 기증자 스트레인 JW4197 성장 (25 µ g/mL) 600에서 광학 밀도를 ~ 1.0 nm (OD600). 분 광 광도 계를 사용 하 여 세600 값을 측정 합니다.</li>
		<li>LB 매체에는 기존 p 1 살 균 소 주식의 희석 시리즈를 만들기: 희석은 10-3 10-7을 권장.</li>
		<li>세균성 펜션과 15 mL 원심 분리기 관 또는 이와 동등한 주어진된 살 균 소 희석의 100 μ의 믹스 200 μ. 살 균 소 희석으로 많은 튜브를 준비 합니다. 동요 하지 않고 37 ° C에서 20 분 동안 튜브를 품 어.</li>
		<li>녹은 가기 천 (~ 50 ° C) 10mm CaCl2 관에 보충의 ~ 3 mL를 추가 하 고 내용을 철저 하 게 혼합 vortexing에 의해 관 곧, 심지어 레이어를 만들기 위해 prewarmed 파운드 접시에 혼합물을 부 어.</li>
		<li>37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysate 준비
	<ol>
<li>다음 날 살 균 소 패의 세미 confluent 성장과 플레이트를 선택 합니다. 약 절반의 표면적 접시 반 confluent 접시에 분명 하다 (그림 3).</li>
		<li>접종 루프 또는 비슷한 도구를 사용 하 여 같은 접시에서 최고 천 층을 긁어과 원심 분리기 튜브에 최고 agar를 놓습니다. 증기 두건에서 파운드의 1-2 mL 및 클로 프롬 및 소용돌이 적극적으로 ~ 1 분 추가 클로 프롬에 대 한 튜브의 한 방울을 추가 합니다.</li>
		<li>4000 g x 또는 더 작은 공의 천 및 세균성 세포에서 15 분 동안 튜브 원심</li>
		<li>신선한 microcentrifuge 튜브, 피하 펠 릿에서 어떤 파편 든 지 운반에 상쾌한을 이동 합니다. 클로 프롬의 2 방울을 추가 하 고 4-10 ° c.에 lysate 저장 증기 두건에서 클로 프롬을 추가 합니다. 마십시오 하지 고정 페이지 lysate로이 전염 성 입자 수의 뜻깊은 감소 귀 착될 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysate titer를 결정
	<ol>
<li>BW25113 LB 문화 OD600 ~ 1.0에 도달할 때까지 37 ° C에서 10 mM CaCl2 보충에서 성장.</li>
		<li>살 균 소 파운드 (예를 들어, 10-6– 10-9)에 lysate의 희석 시리즈 준비. 참고:은 희석을 클로 프롬을 전송 하지 않으려면 lysate의 위에서 피펫으로 샘플에 주의 해야 합니다.</li>
		<li>세균성 펜션과 15 mL 원심 분리기 관 또는 이와 동등한 주어진된 살 균 소 희석의 100 μ의 믹스 200 μ. 살 균 소 희석으로 많은 튜브를 준비 합니다. 동요 하지 않고 37 ° C에서 20 분 동안 튜브를 품 어.</li>
		<li>녹은 가기 천 (~ 50 ° C) 10mm CaCl2 관에 보충의 ~ 3 mL를 추가 하 고 내용을 철저 하 게 혼합 vortexing에 의해 관 곧, 심지어 레이어를 만들기 위해 prewarmed 파운드 접시에 혼합물을 부 어.</li>
		<li>37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어</li>
		<li>다음 날 플 라크 (세균성 매트에 명확한 지역) 각 접시의 수를 계산 하 고 다음 수식을 사용 하 lysate의 titer를 계산: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg"> 예: 접시 희석 10-7, 10-8및 10-9에 있다 231, 27, 2 패, 각각. 각 희석의 100 μ, 감염에 대 한 사용 되었습니다 그리고는 titer 플 라크 형성으로 표현 했기 때문에 단위 (pfu) / mL, 도금 요소는 10. 이 숫자를 수식에 입력 됩니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg"> 따라서,는 titer 약 2 × 1010 전염 성 살 균 소 입자/mL 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. P1 변환
<ol><li>
받는 사람 세포 준비
	<ol>
<li>받는 사람 변형 BL21ΔABCF 파운드 600에서 광학 밀도를 보충 성장 ~ 1.0 nm (OD600). OD600 값을 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다.</li>
		<li>0.5의 감염 (MOI) 값의 다양성을 달성 하는 데 필요한 페이지 lysate의 볼륨을 계산 합니다. 나를 계산 하려면 문화권의 OD600 에 따라 박테리아의 수를 견적 한다. OD600 값이 1.0 ~ 109 cfu/mL에 해당 하는 가정 합니다. lysate의 알려진된 titer에 따라 필요한 볼륨을 계산 합니다. 예 (titer 단계 2.3.6 후 예제에서 계산에 따라): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg">
</li>
		<li>10 m m 받는 사람 긴장 문화 CaCl2 를 추가 하 고 혼합. 변환에 대 한 문화의 1 mL를 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
변환 수행
	<ol>
<li>받는 사람 문화 (를 포함 하 여 10 m m CaCl2 ) 단계 3.1.2에서에서 계산한 1 mL를 파지 lysate의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 참고: 플라스틱 믹스에 클로 프롬을 전송 하지 않으려면 lysate의 상단에서 샘플을 주의 해야 합니다.</li>
		<li>정적으로 37 ° c.에 20 분을 위한 혼합을 품 어</li>
		<li>100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5 추가 하 여 감염을 중지 합니다.</li>
		<li>박테리아 (5000 x g 2 분) centrifuge 고 상쾌한, 다음 100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5로 보충 하는 신선한 파운드의 1 mL에 그들을 resuspend.</li>
		<li>세포 단계 무료 페이지 및 칼슘의 제거를 보장 하기 위해 3.2.4 에서처럼 두 번 더 씻는 다.</li>
		<li>100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5로 보충 하는 신선한 파운드의 1 mL에 박테리아 resuspend (> 100 rpm)를 흔들어 1 h 30 ° C에서 박테리아를 품 어.</li>
		<li>원심 (5000 x g 2 분)에 의해 박테리아를 수집 하 고 100 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5와 파운드의 ~ 100 μ에 그들을 resuspend.</li>
		<li>25 µ g/mL와 10 m m 나트륨 구 연산 염, pH 5.5에서 칸으로 보충 하는 파운드 플레이트에 박테리아를 확산 하 고 식민지 (~ 24 h)이 나타날 때까지 30 ° C에서 박테리아를 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
transductants를 선택 하면
	<ol>
<li>식민지는 선택 접시에 성장 했다, 일단 단일 식민지를 위한 파운드 + 칸에 그들을 restreak 단일 식민지 나타납니다까지 30 ° C에서 성장 하 고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 절 개 칸 카세트
<ol><li>
재조합 플라스 미드 전이
	<ol>
<li>관 저항 BL21ΔABCF 긴장 electrocompetent를 확인 합니다.<ol>
<li>신선한 파운드 (5 mL) 칸 보충에 단일 식민지에서 스트레인 성장 (25 µ g/mL) OD600 ~0.5-0.7까지 30 ° C에서.</li>
			<li>여기에서에, 다음 단계 또는 얼음에 4 ° C에서 실시 합니다. Centrifuge 박테리아 (5000 x g 10 분) 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
			<li>이전 원심 분리 단계를 반복 하 여 두 번 차가운 증류수와 셀 펠 릿을 세척 하 고, 마지막으로, 얼음 10% 글리세롤의 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		</ol>
</li>
		<li>1mm electroporation 큐 벳 얼음에 식혀.</li>
		<li>세포 현 탁 액을 플라스 미드 DNA (pCP20)의 1 세를 추가 하 고 부드럽게, 현 탁 액을 혼합 냉각된 electroporation 베트에 그것을 전송.</li>
		<li>1.8는 electroporator 설정 kV 및 electroporate 셀.</li>
		<li>SOC 매체의 1 mL을 추가 하 고 1 h 30 ° c.에 대 한 그들을 성장 하 여 변형 된 세포를 구출</li>
		<li>파운드에 셀의 100 µ L 플레이트 + 앰프 플레이트와 하룻밤 30 ° C에서 세포를 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재결합의 유도
	<ol>
<li>선택 단일 식민지 파운드 + 앰프에서 접시 하 고 접종 신선한 파운드 모든 항생제를 생략.</li>
		<li>FLP recombinase의 표현을 유도 하룻밤 비 허용 온도 (43 ° C)에서 세포 성장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recombinants 선택
	<ol>
<li>직렬 희석 하 고 만들고, 비 선택적 접시에 105-106 희석의 50 µ L 플레이트 하룻밤 30 ° c.에서 그것을 성장합니다</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. 유전자 삭제 확인
<ol><li>
플라스 미드 손실 및 성공적인 재결합의 확인
	<ol>
<li>격판덮개에서 행진 한 식민지 파운드 + 칸, 파운드 + 앰프, 그리고 파운드에 4.3.1 단계에서이 순서로 항생제 없이 접시 준비. 줄무늬에 투입, 식민지 표 사용 하 여 ( 보충 파일 1참조). 식민지 (~ 24 h)이 나타날 때까지 30 ° C에서 번호판을 성장.</li>
		<li>비 선택적 접시에 성장 하지만 추가 확인에 대 한 선택적 미디어에 성장 하지 못했습니다 10-20 클론을 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
식민지 PCR에 의해 추가 확인
	<ol>
<li>식민지 PCR 뇌관 순서 코딩 타 마 측면으로 수행 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>마스터 PCR 혼합을 준비 합니다. 필요 믹스 ( 표 1의 예를 참조) 테스트 하는 식민지의 수에 따라 다릅니다. 얼음에 시 약을 혼합, 마지막에 중 합 효소를 추가 합니다.</li>
		<li>철저 하 게, PCR 마스터 믹스를 섞어 다음 20 µ L를 PCR 스트립의 튜브로 분배. 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 상영 될 각 식민지의 작은 금액을 선택 하 고 튜브를 추가. 비교를 위해 원래 받는 사람 긴장을 포함 하도록 하십시오. 선택적으로, 기증자 스트레인 포함.</li>
		<li>PCR 반응 실행 (사용 하는 프로그램에 대 한 표 2 참조).</li>
		<li>1 %agarose 젤 준비.<ol>
<li>50ml 젤 agarose의 0.5 g을 측정 하 고 태 버퍼 (40 m m Tris, 20 mM 아세트산 그리고 1 mM EDTA, pH 8.0) 50 mL를 추가 합니다. 모든 agarose 해산 했다 때까지 렌지에 혼합물을 열.</li>
			<li>agarose 해산 했다, 일단 약 50 ° C에 대 한 해결책을 냉각 하 고 염료를 착 색 하는 DNA의 5 μ를 추가 합니다. 솔루션을 잘 혼합 하 고 주조 챔버에 젤 트레이에 부 어. 분자 크기 마커 뿐만 아니라 모든 샘플에 대 한 충분 한 웰 스는 잘 빗의 하나 이상의 행을 삽입 합니다. 30 분 설정 하 젤을 허용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR 실행 완료 되 면 각 샘플을 DNA 로드 염료 x 6의 4 µ L를 추가 합니다. 젤 전기 이동 법 챔버에 배치 하 고 우물 덮여 때까지 태 버퍼를 추가 합니다.</li>
		<li>젤에 잘 각 PCR 반응에서 10-15 µ L를 적용 합니다. 또한 분자 크기 마커의 5 µ L를 추가 합니다. 그런 다음 75 V에서 30 분 동안 젤을 실행 합니다.</li>
		<li>실행 완료 되 면 젤 블루 빛 영상 장치를 사용 하 여 이미지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 기타 기술
<ol><li>
단백질 표정 참고: 테스트 단백질 (YadA와 EibD)의 표현 되었습니다23,24다른 곳에서 상세히 설명. 이것은 주요 단계에 대 한 간단한 요약입니다.<ol>
<li>BL21ΔABCF Δ타 with 필요한 플라스 미드 (pIBA2-쫑 알, pEibD10 및 해당 제어 플라스 미드)를 변환 하 고 transformants 파운드 + 앰프에 대 한 선택.</li>
		<li>단백질 표정에 대 한 변형 된 박테리아의 숙박 문화의 1 mL와 함께 파운드 매체 + 앰프의 100 mL를 접종 하 고 30 ° C에서이 시간에 중간 로그 단계까지 성장, (100 ng/mL)에서 어느 anhydrotetracycline와 단백질 생산을 유도 하거나 이소프로필 thiogalactoside (0.5 m m).</li>
		<li>30 ° C에서 유도의 2 h 문화의 탁도 측정 하 고 OD600 에서 50 mL에 해당 하는 셀의 수를 수집 후 4000 x g에서 15 분 동안 문화 centrifuging 여 1.0 =. 펠 릿을 세척 1 x 10 mm HEPES, pH 7.4, 그리고 중-20 ° C 또는 프로세스 단계 6.2 에서처럼 추가 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
외부 막 추출 참고: 외부 막 추출 레오 외 에 의해 세부 사항에 설명 된 대로 수행 됩니다. 27. 주요 단계 아래 요약 되어 있습니다.<ol>
<li>10 mm HEPES, pH 7.4, resuspend 1 mL에 셀 펠 릿 10 mM MgCl2 , MnCl2, lysozyme (0.1 mg/mL), 및 DNase의 핀치 나 보충.</li>
		<li>(예를 들어, 구슬 때리는 사용 하 여) 셀 lyse</li>
		<li>세포 파편을 제거 하 고 신선한 튜브에는 상쾌한 이동 곧 셀 (15,600 x g2 분)을 원심.</li>
		<li>16000 x g에서 30 분 동안 셀 후 원심, 10 mM HEPES, pH 7.4에에서 1% N lauroyl sarcosine의 400 μ에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>실 온에서 30 분 동안 교 반 후 셀을 품 어, 위와 같이 30 분 동안 원심.</li>
		<li>세척은 반투명 1 x 10 mm HEPES, pH 7.4, 200 μ와 작은 10 mm HEPES 30 μ에 resuspend 그리고 SDS 페이지 샘플 버퍼 x 4의 10 μ를 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
활동 분석 실험 참고: 설명28YadA와 EibD에 대 한 SDS 페이지 및 활동 분석 실험을 수행 합니다. 주요 단계는 아래에 요약 된다.</li>
	<li>
SDS 페이지
	<ol>
<li>단백질을 변성 시키기 방지 하려면 polyacrylamide 젤에 그들을 로드 하기 전에 5 분 동안 50 ° C에서 샘플을 열.</li>
		<li>SDS 페이지에서 분리 후 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 단백질을 전송 합니다.</li>
		<li>송금 후 PBS에 2% 무 지방 우유 파우더 막을 차단 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
뭐라 나 콜라겐 멀리 서쪽 오 점
	<ol>
<li>차단, 후 10 μ g/mL의 농도에 블로킹 버퍼에 소 콜라겐 유형 나 희석을 추가 하 고 1 시간에 대 한 막 품 어.</li>
		<li>막 2 워시 x PBS + 0.05 %Tween20 (PBS-T).</li>
		<li>블로킹 버퍼에 막에 1 차적인 항 체 (단일 클로 널 항 콜라겐 COL-1), 희석된 1:2,000를 추가 합니다.</li>
		<li>잠복기 1 h 막, 후 6.3.2.2 단계에서 언급 한 대로 2 배를 세척 하 고 이차 항 체 [염소 반대로 마우스 IgG-양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 켤레], 희석된 1:10,000 블로킹 버퍼에 추가 합니다.</li>
		<li>1 시간에 대 한 막 품 어 다음 그것을 씻어 PBS. 2 x 향상 된 chemiluminescent 기판 제조업체의 지침에 따라 막에 추가 하 고 CCD 카메라를 사용 하 여 밴드를 감지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EibD IgG 바인딩 분석 결과
	<ol>
<li>차단, 이차 항 체 (염소 안티 토끼 HRP), 희석 1:2,000 블로킹 버퍼에 추가 합니다.</li>
		<li>1 시간에 대 한 막 품 어 다음 그것을 씻어 PBS 가진 2 x. 6.3.2.5 단계에서 언급 한 대로 chemiluminescent 감지를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blount, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unexhausted+potential+of+E.+coli.">The unexhausted potential of E. coli.</a> eLife. 4, e05826 (2015).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).</li><li>Link, A. J., Phillips, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+precise+deletions+and+insertions+in+the+genome+of+wild-type+Escherichia+coli:+application+to+open+reading+frame+characterization.">Methods for generating precise deletions and insertions in the genome of wild-type Escherichia coli: application to open reading frame characterization.</a> Journal of Bacteriology. 179 (20), 6228-6237 (1997).</li><li>Sawitzke, J. A., Thomason, L. C., Costantino, N., Bubunenko, M., Datta, S., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombineering:+in+vivo+genetic+engineering+in+E.+coli,+S.+enterica,+and+beyond.">Recombineering: in vivo genetic engineering in E. coli, S. enterica, and beyond.</a> Methods in Enzymology. 421, 171-199 (2007).</li><li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products.">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li><li>Muyrers, J. P., Zhang, Y., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques:+Recombinogenic+engineering--new+options+for+cloning+and+manipulating+DNA.">Techniques: Recombinogenic engineering--new options for cloning and manipulating DNA.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (5), 325-331 (2001).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame,+single-gene+knockout+mutants:+the+Keio+collection.">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, (2006).</li><li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+Keio+collection+of+Escherichia+coli+single-gene+deletion+mutants.">Update on the Keio collection of Escherichia coli single-gene deletion mutants.</a> Molecular Systems Biology. 5, 335 (2009).</li><li>Baba, T., Huan, H. -. C., Datsenko, K., Wanner, B. L., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+applications+of+systematic+in-frame,+single-gene+knockout+mutant+collection+of+Escherichia+coli+K-12.">The applications of systematic in-frame, single-gene knockout mutant collection of Escherichia coli K-12.</a> Methods in Molecular Biology. 416, 183-194 (2008).</li><li>Chattopadhyay, M. K., Tabor, C. W., Tabor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyamines+are+not+required+for+aerobic+growth+of+Escherichia+coli:+preparation+of+a+strain+with+deletions+in+all+of+the+genes+for+polyamine+biosynthesis.">Polyamines are not required for aerobic growth of Escherichia coli: preparation of a strain with deletions in all of the genes for polyamine biosynthesis.</a> Journal of Bacteriology. 191 (17), 5549-5552 (2009).</li><li>Xie, X., Wong, W. W., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+simvastatin+bioconversion+in+Escherichia+coli+by+deletion+of+bioH.">Improving simvastatin bioconversion in Escherichia coli by deletion of bioH.</a> Metabolic Engineering. 9 (4), 379-386 (2007).</li><li>Maeda, T., Sanchez-Torres, V., Wood, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+hydrogenase+3+is+a+reversible+enzyme+possessing+hydrogen+uptake+and+synthesis+activities.">Escherichia coli hydrogenase 3 is a reversible enzyme possessing hydrogen uptake and synthesis activities.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (5), 1035-1042 (2007).</li><li>Meehan, B. M., Landeta, C., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disulfide+bond+formation+pathway+is+essential+for+anaerobic+growth+of+Escherichia+coli.">The disulfide bond formation pathway is essential for anaerobic growth of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 199 (16), (2017).</li><li>Niba, E. T. E., Naka, Y., Nagase, M., Mori, H., Kitakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+approach+to+identify+the+genes+involved+in+biofilm+formation+in+E.+coli.">A genome-wide approach to identify the genes involved in biofilm formation in E. coli.</a> DNA Research. 14 (6), 237-246 (2008).</li><li>Heinz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+features+in+the+structure,+mechanism,+and+biogenesis+of+the+inverse+autotransporter+protein+family.">Conserved features in the structure, mechanism, and biogenesis of the inverse autotransporter protein family.</a> Genome Biology and Evolution. 8 (6), 1690-1705 (2016).</li><li>Selkrig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+an+archetypal+protein+transport+system+in+bacterial+outer+membranes.">Discovery of an archetypal protein transport system in bacterial outer membranes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 19 (5), 506-510 (2012).</li><li>Stubenrauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+assembly+of+fimbriae+in+Escherichia+coli+depends+on+the+translocation+assembly+module+nanomachine.">Effective assembly of fimbriae in Escherichia coli depends on the translocation assembly module nanomachine.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16064 (2016).</li><li>Leo, J. C., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunoglobulin-binding+Eib+proteins+from+Escherichia+coli+are+receptors+for+IgG+Fc.">The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).</li><li>M&#252;hlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Sch&#252;tz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+adhesin+A+(YadA)+-+Beauty+&amp;+beast.">Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty &amp; beast.</a> International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).</li><li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes.">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).</li><li>Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strain+collection+for+improved+expression+of+outer+membrane+proteins.">A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li><li>Grosskinsky, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+glycine+residue+of+trimeric+autotransporter+domains+plays+a+key+role+in+Yersinia+adhesin+A+autotransport.">A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport.</a> Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).</li><li>Leo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+E.+coli+IgG-binding+protein+D+suggests+a+general+model+for+bending+and+binding+in+trimeric+autotransporter+adhesins.">The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins.</a> Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+lysogenesis.+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Escherichia+coli.">Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+outer+membrane+insertion+and+folding+of+multimeric+transmembrane+&#946;-barrel+proteins.">Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane &#946;-barrel proteins.</a> Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).</li><li>Mikula, K. M., Leo, J. C., &#321;yskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translocation+domain+in+trimeric+autotransporter+adhesins+is+necessary+and+sufficient+for+trimerization+and+autotransportation.">The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation.</a> Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).</li><li>Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+genome+manipulation+by+P1+transduction.">E. coli genome manipulation by P1 transduction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).</li><li>Franklin, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+gal+U+gene+of+E.+coli+blocks+phage+P1+infection.">Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection.</a> Virology. 38 (1), 189-191 (1969).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequences+of+Escherichia+coli+B+strains+REL606+and+BL21(DE3).">Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3).</a> Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).</li><li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Alignment+during+Homologous+Recombination.">DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).</li><li>Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology+requirements+for+recombination+in+Escherichia+coli.">Homology requirements for recombination in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).</li><li>Ho, T. D., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7+gal+mutants+are+sensitive+to+bacteriophage+P1+and+defective+in+intestinal+colonization.">Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).</li><li>Ikeda, H., Tomizawa, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducing+fragments+in+generalized+transduction+by+phage+P1.+I.+Molecular+origin+of+the+fragments.">Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments.</a> Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).</li><li>Murooka, Y., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+host+range+of+coliphage+P1+and+gene+transfer+from+enteric+bacteria+to+other+Gam-negative+bacteria.">Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).</li><li>Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+selection+for+P1-sensitive+mutants+of+enteric+bacteria.">Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).</li><li>O'Connor, K. A., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coliphage+P1-mediated+transduction+of+cloned+DNA+from+Escherichia+coli+to+Myxococcus+xanthus:+use+for+complementation+and+recombinational+analyses.">Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses.</a> Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).</li></ol>

저자는 공개 없다.

P1 변환 대장균에 유전자 삭제를 생성 하기 위한 빠르고, 강력 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 여기 BL21 파생 된 받는 사람에 게 케이오 기증자 스트레인에서 타 마 삭제 돌연변이 시험에 의해 증명 됩니다. 변환 프로세스의 주요 단계는 lysate는 시험의 생산, 자체 변환, 칸 저항 카세트의 절단 및 PCR에 의해 녹아웃의 확인. 총에서 과정 약 1 주일 소요 하며 확인에 대 한 최종 PCR를 ?...

유전자의 기능 연구에 대 한 일반적인 첫 번째 접근 노크 아웃 mutagenesis 수행 결과 표현 형을 관찰 하는 것입니다. 이것은 또한 반전 유전학을 불린다. 지난 70 년 동안 또는 이렇게, 그것의 경작 및의 순종 유전자 조작1의 용이성으로 인해 박테리아 대장균 분자 생물학의 주력 하고있다. 여러 가지 방법은 대장균, 등 표식 exchange mutagenesis2,3 , 더 최근에, λ 레드 또는 Rac 외 시스템4,5 를 사용 하 여 recombineering에에서 유전자 삭제를 생산 하기 위해 개발 되었습니다. , 6.
널리 사용 되는 시스템에서 개별 유전자의 코딩 시퀀스에서 염색체5,7excised 나중 수는 항생제 저항 카세트로 대체 됩니다. 코딩 시퀀스 대체 된다, 예를 들어 대 (칸) 저항 카세트, 양쪽에 flippase (FLP) 인식 대상 (FRT) 사이트에 의해 형벌 이다. FRT 사이트 recombinase 칸 카세트의 삭제로 이어지는 FRT 사이트 간의 사이트 재결합 중재 FLP에 의해 인식 됩니다. 이 방법에서는, 주어진된 유전자의 코딩 시퀀스의 전체 삭제 얻을 수 있습니다, 약 100의 기본적인 쌍 (bp) (그림 1)의 순서만 최소한의 흉터를 남겨두고.
전 10 년 넘게 소위 게이오 컬렉션 개발 되었다. 이것은 세균성 라이브러리 기반 표준 실험실 대장균 K12 변형, 거의 모든 비-필수 유전자 λ 빨간 재결합7,8에 의해 개별적으로 삭제 되었습니다. 이 컬렉션에서 클론 excisable 칸 저항 카세트 교체의 코딩 시퀀스 한 개 있다. 케이오 컬렉션9많은 응용 프로그램 대 한 유용한 도구가 될 입증 되었습니다. 하나는 같은 응용 프로그램 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이의 생산 이다. 일반적으로 살 균 소, P110,11,12,,1314등을 시험 하 여 주어진된 삭제 복제에서 칸 카세트를 동원 수 있습니다. 살 균 소 주식 같은 긴장에서 준비 사용할 수 있습니다 받는 사람의, E. 콜라이 긴장을 감염 하 어디 낮은 하지만 신뢰할 수 있는 주파수는 칸에서 카세트 포함 된 지역 포함 될 수 있습니다 받는 사람 게놈으로 동종 재결합에 의해 (그림 2)입니다. Transductants 칸 포함 된 매체에 성장에 대 한 선택할 수 있습니다. 이 따라 항생제 저항 카세트의 제거를 원하는 경우 트랜스 transductant 변형에 FLP recombinase 공급 수 있다. FLP 포함 된 플라스 미드, 암 피 실린 (Amp) 저항 마커를 운반, 경화 후 칸와 앰프-민감한 클론에 대 한 검사는 하 고 야생-타입 코딩 순서와 칸 카세트의 정확한 절단 식민지 PCR에 의해 확인 됩니다.
여기, 상세한 프로토콜 제공 됩니다, 각 녹아웃 대장균 스트레인 위에서 설명한 전략에 따라 생산 단계를 설명 하. 예를 들어, 타 마 유전자의 삭제는 보여 줍니다. 타 마 일부 전송 및 어셈블리 모듈 (TAM), 특정 autotransporter 단백질 및 pili15,,1617의 속에 포함 되는 외부 막 β 배럴 단백질을 인코딩합니다. 이 노크 아웃 긴장은 다음 2 개의 trimeric autotransporter adhesins (다시), 페스트 adhesin YadA와 대장균 면역 글로불린 (Ig)는 속에 다 마 삭제의 효과 검사 하는 데 사용 됩니다-TAA EibD 바인딩 18,19.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BW25113</td><td>NIG</td><td>ME6092</td><td>Wild-type strain of Keio collection</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21(DE3)</td><td>Merck</td><td>69450-3</td><td>Expression strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21DABCF</td><td>Addgene</td><td>102270</td><td>Derived from BL21(DE3)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; JW4179</td><td>NIG</td><td>JW4179-KC</td><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; deletion mutant</td></tr><tr><td>P1 &lt;em&gt;vir&lt;/em&gt;</td><td>NIG</td><td>HR16</td><td>Generally transducing bacteriophage</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCP20</td><td>CGSC</td><td>14177</td><td>conditionally replicating plasmid with FLP</td></tr><tr><td>pASK-IBA2</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1301-000</td><td>expression vector</td></tr><tr><td>pEibD10</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>for production of EibD; plasmid available on request</td></tr><tr><td>pET22b+</td><td>Merck</td><td>69744-3</td><td>expression vector</td></tr><tr><td>pIBA2-YadA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>for production of YadA; plasmid available on request</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>ThermoFisher</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline</td><td>Abcam</td><td>ab145350</td><td></td></tr><tr><td>anti-collagen type I antibody COL-1</td><td>Sigma</td><td>C2456</td><td></td></tr><tr><td>Bovine collagen type I</td><td>Sigma</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Di-sodium hydrogen phosphate</td><td>VWR</td><td>28029</td><td></td></tr><tr><td>DNA dye</td><td>Thermo</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>DNA molecular size marker</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>ECL HRP substrate</td><td>Advansta</td><td>K-12045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>24388</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit IgG-HRP</td><td>Agrisera</td><td>AS10668</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>30487</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl thiogalactoside</td><td>VWR</td><td>43714</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Applichem</td><td>A4972</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>VWR</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-lauroyl sarcosine</td><td>Sigma</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk powder</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27808</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; forward primer</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5&#039;-GAAAAAAGG&lt;br /&gt;ATATTCAGGAGAAAATGTG-3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5&#039;-TCATAATT&lt;br /&gt;CTGGCCCCAGACC-3&#039;</td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>VWR</td><td>84610</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Merck</td><td>103753</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis chamber</td><td>Hoefer</td><td>SUB13</td><td></td></tr><tr><td>Bead beater</td><td>Thermo</td><td>FP120A-115</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Kodak</td><td>4000R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation unit</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Gel imager</td><td>Nippon Genetics</td><td>GP-03LED</td><td></td></tr><tr><td>Incubating shaker</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR</td><td>390-0482</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Microwave oven</td><td>Samsung</td><td>CM1099A</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Biometra</td><td>Tpersonal</td><td></td></tr><tr><td>PCR strips</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2211-01</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>ThermoFisher</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAG electrophoresis chamber</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06322</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>D3006</td><td></td></tr><tr><td>Wet transfer unit</td><td>Hoefer</td><td>TE22</td><td></td></tr></tbody></table>

producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes

박테리아에서 알 수 없는 유전자의 기능 연구에 대 한 첫 번째 접근은이 유전자의 녹아웃을 만드는 것입니다. 여기, 우리는 강력 하 고 빠른 살 균 소 P1 일반화 된 변환 사용 하 여 다른 한 대장균 긴장에서 유전자 삭제 돌연변이 전송 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 돌연변이 선택 가능 (예: 항생제 카세트 삽입을 사용 하 여 유전자 중단에 따라) 해야 합니다. 이러한 항생제 카세트 기증자 긴장에서 동원 될 수 있습니다 관심 받는 사람 부담으로 신속 하 게 도입 하 고 쉽게 유전자 삭제 돌연변이 생성. 항생제 카세트 사이트별 recombinase 게놈에서 순서 ~ 100-기지-쌍-긴 흉터만 깨끗 한 녹아웃을 생산 하 여 카세트의 절단을 허용 하는 flippase 인식 사이트를 포함 하도록 디자인할 수 있습니다. 우리는 어셈블리 요소 autotransporter 속에 관련 된 인코딩 타 유전자를 노크 하 여 프로토콜을 설명 하 고는 속에이 노크 아웃의 효과 및 2 개의 trimeric autotransporter adhesins의 기능 테스트. P1 변환에 의해 유전자 삭제는 한계가, 비록 편리 하 고 속도 구현 하기가 유전자 삭제의 다른 방법에 매력적인 대안.

세대는 타 마 노크 아웃 BL21ΔABCF의의:
위에서 설명한 전략은 이전 BL21(DE3), 외부 막 단백질 생산을 위한 최적화 이며 BL21ΔABCF21라는 단백질 생산에 사용 되는 표준 실험실 긴장의 파생 긴장을 생산 하기 위해 사용 되었습니다. 이 긴장 풍부한 외부 막 단백질을 코딩 하는 4 개의 유전자를 부족 하 고, 따라서,...

Watch this Scientific Journal Video about Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes at JoVE.com

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

여기 선물이 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이 만들기 위한 기반으로 기존의 항생제 저항-카세트 삭제 구문을 사용 하는 프로토콜. 이러한 삭제 돌연변이 동원 고 P1 살 균 소 변환을 사용 하 여 받는 사람 긴장의 해당 장소에 삽입 될 수 있습니다.

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

producing-gene-deletions-escherichia-coli-p1-transduction-with

Research

JoVE Journal

Genetics

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

17.0K 조회수.  University of Oslo. 여기 선물이 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이 만들기 위한 기반으로 기존의 항생제 저항-카세트 삭제 구문을 사용 하는 프로토콜. 이러한 삭제 돌연변이 동원 고 P1 살 균 소 변환을 사용 하 여 받는 사람 긴장의 해당 장소에 삽입 될 수 있습니다.

비디오: Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

연구

생체공학

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

유전학

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

실험적 진화 접근법에서 플라스미드 매개 항생제 내성의 정량화

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

면역학 및 감염병학

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

생물학

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

클라미디아 트라코마티스의 플록세드 카세트 알레릭 교환 돌연변이에 의한 마커리스 유전자 결실

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

생성<em&gt; 엔테로 박터</em&gt; SP. YSU 영양 요구는 트랜스포존 돌연변이 유발을 사용하여

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

항생제 내성의 진화에서 다중 플라스 미드의 역할 테스트

실험적 진화 접근법에서 플라스미드 매개 항생제 내성의 정량화

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑

게놈 전체 유전자 삭제할에

감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성

클라미디아 트라코마티스의 플록세드 카세트 알레릭 교환 돌연변이에 의한 마커리스 유전자 결실

생성

표적 스르나의 파지 매개 배달에 유전자 발현을 허물고 구축