Name: producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes
Uploaded: 2018-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes at JoVE.com

慶應コレクション系統は、ナショナルバイオ リソース プロジェクト (遺伝研, 日本) から得られた:エシェリヒア属大腸菌。彼の継続サポートありがとうダーク リンケ (バイオ サイエンス学科、オスロ大学)。この作品は、ノルウェー若手研究者グラント 249793 (ジャック C. レオ) に研究評議会によって賄われていた。

1 系統とプラスミド
<ol><li>
細菌の緊張
	<ol>
<li>大腸菌株 BW251135JW4179 (BW25113 tamA::kan)7、BL21(DE3)20、および BL21ΔABCF21を使用します。詳細については、材料の表を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
バクテリオファージ
	<ol>
<li>一般的な伝達にバクテリオファージ P1virを使用します。クロロホルムを数滴の液体在庫としてバクテリオファージを格納 (手順 2.2 参照)。詳細については、材料の表を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
プラスミド
	<ol>
<li>このプロトコルでは、次のプラスミドを使用: pCP2022、pIBA2 矢田23、および24pEibD10。制御プラスミドとして pASK IBA2 と pET22b (材料の表を参照) を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
成長の条件
	<ol>
<li>ホストゲノム スープ (LB) 中25 37 ° C または BL21ΔABCF と pCP20 を含む系統の場合 30 ° C で活発な動揺 (180-200 rpm) の中の細菌に伝達します。</li>
		<li>43 ° C で硬化性プラスミドを実行します。</li>
		<li>固体培地の寒天 1% (w/v) ポンドを補足します。</li>
		<li>上の寒天の 0.7% 寒天と 10 mM CaCl2とオートクレーブ中で LB を補足します。エレクトロポレーション26後回復のため SOC 培地を使用します。</li>
		<li>抗生物質のため下記の濃度を使用: アンプと菅の 25 μ g/mL の 100 μ g/mL</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 ファージ Lysate を準備します。
<ol><li>
ドナー株の感染
	<ol>
<li>5 mL の LB 培 10 mM CaCl2とし、必要に応じて菅でドナー株 JW4197 を成長 (25 μ g/mL) 600 の光学濃度に 〜 1.0 nm (外径600)。分光光度計を用いた OD600の値を測定します。</li>
		<li>LB 培地で既存の P1 バクテリオファージ株式の希釈系列を作る: 10-3 10-7~ 間の希釈を推奨します。</li>
		<li>細菌懸濁液と与えられたファージ希釈 15 mL 遠心管またはそれと同等の 100 μ L のミックス 200 μ L。バクテリオファージ希釈として多くのチューブを用意します。振ることがなく 37 ° C で 20 分間チューブを孵化させなさい。</li>
		<li>チューブに 10 mM CaCl2を添加した溶の上の寒天 (~ 50 ° C) 〜 3 mL を加えてミックス内容に徹底的にボルテックス チューブ、まもなくも層を作る prewarmed LB プレートの上に混合物を注ぐ。</li>
		<li>37 ° C で一晩版を孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ライセート作製
	<ol>
<li>次の日は、バクテリオファージのプラクの半合流成長とプレートを選択します。半合流プレートの約半分の表面積プレートは明らか (図 3)。</li>
		<li>接種ループまたは同様のツールを使用してこのようなプレートから上の寒天層をこすり、遠心管中上の寒天を配置します。ヒューム フードの LB の 1-2 mL とクロロホルムと渦 ~ 1 分追加、クロロホルムは積極的にチューブのドロップを追加します。</li>
		<li>寒天と菌体ペレットへ 4,000 g以上で 15 分の管を遠心します。</li>
		<li>ペレットからの残骸の上に運ぶ回避する新鮮な遠心チューブに上清を移動します。クロロホルムの 2 滴を追加し、4-10 ° c. でライセートを格納ヒューム フードのクロロホルムを追加します。これは伝染性の粒子の数の大幅な削減になりますので、ライセートすぎるバクテリオファージは凍結しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
溶解液の力価を決定します。
	<ol>
<li>37 ° C で 10 mM CaCl2文化 〜 1.0 の外径 φ600まで添加した LB の BW25113 に成長します。</li>
		<li>LB (例えば、10-6– 10-9) の lysate のバクテリオファージの希釈系列を調製します。 注: 必ずピペット、サンプルを希釈するクロロホルムの転送を避けるために lysate の上から。</li>
		<li>細菌懸濁液と与えられたファージ希釈 15 mL 遠心管またはそれと同等の 100 μ L のミックス 200 μ L。バクテリオファージ希釈として多くのチューブを用意します。振ることがなく 37 ° C で 20 分間チューブを孵化させなさい。</li>
		<li>チューブに 10 mM CaCl2を添加した溶の上の寒天 (~ 50 ° C) 〜 3 mL を加えてミックス内容に徹底的にボルテックス チューブ、まもなくも層を作る prewarmed LB プレートの上に混合物を注ぐ。</li>
		<li>37 ° C で一晩版を孵化させなさい</li>
		<li>次の日は、各プレートのプラーク (細菌のマットで明確な地域) の数をカウントし、次の数式を使用して、溶解液の力価を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg"> 例: 希釈 10-7, 10-810-9とプレートにあり 231、27、2 プラク、それぞれ。感染症の各希釈 100 μ L を用いてプラーク形成力価が表されるので、単位 (pfu)/mL、めっき因子は 10。これらの数値は、数式に入力されます。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg"> したがって、力価は約 2 × 1010伝染性のバクテリオファージの粒子/mL です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. P1 伝達
<ol><li>
受信者のセルの準備
	<ol>
<li>600 の光学濃度に添加した LB の受信者株 BL21ΔABCF を成長 〜 1.0 nm (外径600)。分光光度計を使用して、外径 φ600の値を測定します。</li>
		<li>ライセートのバクテリオファージの感染 (MOI) 値が 0.5 の多様性を達成するために必要なボリュームを計算します。慣性モーメントを計算するには、文化の OD600に基づいて細菌の数を見積もる。外径600値 1.0 が 10 〜9 cfu/mL に対応することを想定してください。ライセートの知られている力価に基づいて必要な容量を計算します。 (2.3.6 の手順の後の例で計算力価に基づく) の例: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg">
</li>
		<li>10 mm 受信者ひずみ文化に CaCl2を加え、混ぜます。文化伝達のための 1 mL を取る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
伝達を行う
	<ol>
<li>3.1.2 のステップで計算される (CaCl2 10 mm 含む) 受信者の文化の 1 mL に溶解バクテリオファージの適切なボリュームを追加、軽く混ぜます。 注: は、ミックスにクロロホルムを転送しないようにするライセートの上からサンプルをピペットように注意します。</li>
		<li>37 ° C で 20 分のミックスを静的にインキュベートします。</li>
		<li>100 mm pH 5.5、クエン酸ナトリウムを追加することによって感染を停止します。</li>
		<li>細菌 (5,000 × gを 2 分間) を遠心し、上清を除去、100 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.5 と補われる新鮮な LB の 1 mL でそれらを再懸濁します。</li>
		<li>3.2.4 無料ファージとカルシウムの除去を確保するためのステップのようにさらに 2 回細胞を洗浄します。</li>
		<li>100 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.5 と補われる新鮮な LB の 1 mL 中の細菌を再懸濁します。30 ° C (> 100 rpm) の揺れで 1 h で細菌を孵化させなさい。</li>
		<li>遠心分離 (5,000 × gを 2 分間) によって細菌を収集し、100 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.5 の LB の ~ 100 μ L でそれらを再懸濁します。</li>
		<li>25 μ g/mL と 10 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.5、菅と補われる LB プレートに細菌を広げるし、植民地 (~ 24 h) が表示されるまでに、30 ° C でバクテリアします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
形質を選択します。
	<ol>
<li>植民地選択板で育った、単一コロニーのためポンド + 菅にそれらを restreak、シングル コロニーが表示されるまで、30 ° C で成長します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 常套菅カセット
<ol><li>
組換えのプラスミッドの変形
	<ol>
<li>菅耐性 BL21ΔABCF ひずみ electrocompetent を確認します。<ol>
<li>菅首相は補われる新鮮な LB (5 mL) の単一コロニーから株を成長 (25 μ g/mL) 30 ° c まで OD600 ~0.5 – 0.7。</li>
			<li>ここから、4 ° c または氷の上、次の手順を実行します。細菌 (5,000 × gで 10 分間) を遠心し、上清を除去します。</li>
			<li>2 回前の遠心分離のステップを繰り返すことによって冷たい蒸留水細胞ペレットを洗浄し、最後に、氷冷 10% グリセロールの 100 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>氷の上 1 mm エレクトロポレーション キュベットを冷やします。</li>
		<li>細胞懸濁液にプラスミド (pCP20) の 1 pg を追加、穏やか、懸濁液に混合し、冷却エレクトロポレーション キュベットに転送。</li>
		<li>本体を 1.8 に設定 kV および electroporate 細胞。</li>
		<li>SOC 培地 1 mL を追加し、30 ° C で 1 時間のそれらの成長によって変換されたセルを救出します。</li>
		<li>ポンド上のセルの 100 μ L をプレート + アンプ板し一晩 30 ° C で細胞を成長します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
再結合の誘導
	<ol>
<li>LB + アンプからシングル コロニーをピックアップ プレートし、すべての抗生物質を省略する新鮮な LB を接種します。</li>
		<li>FLP リコンビナーゼの発現を誘導するために一晩の非寛容な温度 (43 ° C) でセルを育てなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recombinants を選択します。
	<ol>
<li>シリアルの希薄を作ると非選択式ナンバー プレートに 105-106希釈の 50 μ L をプレートし、一晩 30 ° c. でそれを育てる</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 遺伝子欠失の検証
<ol><li>
成功した組換えプラスミドの損失の検証
	<ol>
<li>ストリーク プレート ステップ 4.3.1 LB + 菅、LB + アンプで準備からこの順序で、抗生物質がない LB プレート シングル コロニー。ストリー キングの支援するためコロニー グリッドを使用 (補足のファイル 1を参照してください)。植民地 (~ 24 h) が表示されるまで、30 ° C でプレートを成長します。</li>
		<li>非選択的プレート上に成長したが、さらに検証のための選択培地で成長に失敗しました 10-20 クローンを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
コロニー PCR による追加検証
	<ol>
<li>並ぶ多摩コーディング配列のプライマーとコロニー PCR を実行 (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>PCR のマスターの組合せを準備します。必要なミックスは、(表 1の例を参照してください) テストするコロニーの数によって異なります。氷の試薬を混ぜて、最後ポリメラーゼを追加します。</li>
		<li>PCR マスター ミックスを混和し、PCR ストリップのチューブに 20 μ L を分注します。少量の滅菌ピペット チップを使用して上映される各コロニーをピックアップし、それをチューブに追加します。比較のため、元の受信者ひずみを含めるようにしてください。必要に応じて、ドナーの負担があります。</li>
		<li>PCR の反作用を実行 (使用プログラムの表 2を参照)。</li>
		<li>1% の agarose のゲルを準備します。<ol>
<li>50 mL ゲルの agarose の 0.5 g を測定し、50 mL の TAE バッファー (40 mM トリス、20 mM 酢酸と 1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) を追加します。すべて agarose が溶けるまで電子レンジでの混合物を加熱します。</li>
			<li>Agarose が解散後約 50 ° C にソリューションを冷却し、DNA 染色色素の 5 μ L を追加します。ソリューションをよく混合し、鋳造の部屋でゲル トレイにそれを注ぐ。すべてのサンプルを分子量マーカーの十分な井戸があります、よく櫛の 1 つまたは複数の行を挿入します。30 分に設定するゲルを許可します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR の実行が完了すると、各サンプルに 4 μ L の DNA 読み込み染料 × 6 を追加します。ゲルの電気泳動室にし、井戸が覆われているまでに TAE バッファーを追加します。</li>
		<li>10-15 μ L をゲルの井戸に各 PCR の反作用から適用されます。分子量マーカーの 5 μ L を追加もできます。その後、75 V で 30 分のためのゲルを実行します。</li>
		<li>実行が完了すると、青の光の撮像素子を使用してゲルをイメージします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. その他のテクニック
<ol><li>
蛋白質の表現 注: テスト蛋白質 (矢田・ EibD) の表情をしています23,24詳細他の場所で説明されています。これは、主な手順の概要です。<ol>
<li>BL21ΔABCF Δ多摩 wi 番目に必要なプラスミド (pIBA2 矢田と pEibD10 と対応する制御プラスミド) を変換し、LB + アンプの形質転換体の選択。</li>
		<li>蛋白質の表現のため一晩培養変形中の 1 mL の LB 培地 + アンプの 100 mL を接種してその時点での中間ログ段階まで 30 ° C で栽培、(100 ng/mL) でいずれかの anhydrotetracycline を持つ蛋白質の生産を誘発するか(0.5 mM) でイソプロピル thiogalactoside。</li>
		<li>30 ° C で誘導の 2 h 文化の濁度を測定し、OD600で 50 mL に対応するセルの数を収集した後は、4,000 x gで 15 分間文化を遠心分離によって 1.0 を = します。餌を洗浄 1 x 10 mm HEPES、pH 7.4 では、し、いずれかは-20 ° C またはプロセス ステップ 6.2 のようにさらにそれでそれを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
外膜抽出 メモ: 外膜抽出は実行されますレオらによって詳細に説明されているよう27. 主な手順を以下に記載します。<ol>
<li>10 mm HEPES、pH 7.4 では、1 mL の細胞ペレットを再懸濁します補足 10 mM MgCl2と MnCl2リゾチーム (0.1 mg/mL)、DNase のピンチと私。</li>
		<li>(例えばビード ・ ビーターを使用して) 細胞を溶解させます。</li>
		<li>細胞の残骸を削除し、新鮮なチューブに上清を移動直後のセル (15,600 x gで 2 分) を遠心します。</li>
		<li>16,000 x gで 30 分間細胞を遠心分離後、1 %n ラウロイル サルコシン 10 mM HEPES、pH 7.4 の 400 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
		<li>その後、室温で 30 分間撹拌で細胞をインキュベート、上記として 30 分のそれらを遠心分離機します。</li>
		<li>洗って、半透明ペレットを 10 mM HEPES、pH 7.4 では、200 μ l 1 x 10 mM HEPES の 30 μ L でそれを再懸濁します、4 x SDS-PAGE サンプルバッファーの 10 μ L を追加。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
活性測定法 注: は、として記述されている28矢田と EibD の SDS-PAGE と活性アッセイを実行します。主な手順は以下のとおり。</li>
	<li>
SDS ページ
	<ol>
<li>5 分の 50 ° c のサンプルを加熱すると、タンパク質の変性を避けるために、ポリアクリルアミドのゲルにロードする前に。</li>
		<li>SDS ページの分離、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜に蛋白質を転送します。</li>
		<li>転送後、PBS で 2% 脱脂ミルク パウダーと膜をブロックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
矢田コラーゲン遠い西部のしみ方
	<ol>
<li>ブロック後、10 μ g/mL の濃度にブロック バッファーで希釈私牛由来のコラーゲンの種類を追加、1 h の膜を孵化させなさい。</li>
		<li>2 膜を洗浄する PBS + 0.05% Tween20 x (PBS-T)。</li>
		<li>ブロック バッファー内膜に一次抗体 (モノクローナル抗コラーゲン COL 1)、希薄化後の 1:2,000 を追加します。</li>
		<li>1 h の膜をインキュベート後ステップ 6.3.2.2 で述べたように 2 x を洗浄し、ブロック バッファーで希釈 1: 10,000、二次抗体 [ヤギ抗マウス IgG 西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 共役] を追加します。</li>
		<li>1 h の膜をインキュベートして洗って PBS T で 2 倍製造元の指示に従って膜強化化学発光基質を追加し、CCD カメラを使用してバンドを検出します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EibD IgG 結合の試金
	<ol>
<li>後に、ブロック (ヤギ抗うさぎ HRP)、二次抗体希釈バッファーの妨害に 1:2,000 を追加します。</li>
		<li>1 h の膜をインキュベートして洗って PBS で 2 倍。前述のステップ 6.3.2.5 化学ルミネセンスの検出を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blount, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unexhausted+potential+of+E.+coli.">The unexhausted potential of E. coli.</a> eLife. 4, e05826 (2015).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).</li><li>Link, A. J., Phillips, D., Church, G. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Alignment+during+Homologous+Recombination.">DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).</li><li>Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology+requirements+for+recombination+in+Escherichia+coli.">Homology requirements for recombination in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).</li><li>Ho, T. D., Waldor, M. 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Molecular origin of the fragments.</a> Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).</li><li>Murooka, Y., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+host+range+of+coliphage+P1+and+gene+transfer+from+enteric+bacteria+to+other+Gam-negative+bacteria.">Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).</li><li>Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+selection+for+P1-sensitive+mutants+of+enteric+bacteria.">Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).</li><li>O'Connor, K. A., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coliphage+P1-mediated+transduction+of+cloned+DNA+from+Escherichia+coli+to+Myxococcus+xanthus:+use+for+complementation+and+recombinational+analyses.">Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses.</a> Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).</li></ol>

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P1 伝達は、エシェリヒア属大腸菌の遺伝子の削除を生成するための高速、堅牢で、信頼性の高い方法です。BL21 由来の受信者に慶應義塾ドナーひずみから多摩失変異を伝達でここでこれを示します。伝達プロセスの主要な段階は、ライセートの生産、伝達自体、菅抵抗カセットの切除および PCR によるノック アウトの検証です。合計では、プロセスは約 1 週間ほどかかります、?...

遺伝子の機能を検討する共通の最初のアプローチは、ノックアウト変異を実行し、結果の表現型を観察することです。これはまた逆遺伝学と呼ばれます。最後の 70 年間またはそう、その培養と遺伝子操作1こうして容易なため細菌エシェリヒア属大腸菌分子生物学の主力となっています。エシェリヒア属大腸菌、マーカー交換変異2,3と、最近では、λ 赤または Rac ET システム4,5を使用してジーンを含む遺伝子の削除を生成するいくつかの方法が開発されています。,6。
広く使われているシステムでは、個々 の遺伝子のコード配列が染色体5,7から後で摘出することができます抗生物質耐性カセットに置き換えられます。いずれかの側に flippase (FLP) 認識対象 (FRT) サイトが並ぶされているカナマイシン (菅) 抵抗カセットによって例えばコーディング シーケンスが置き換えられます。FRT サイトは菅カセットの削除につながる FRT サイト間の部位特異的組換えを媒介する FLP リコンビナーゼによって認識されます。この方法で、約 100 塩基対 (bp) (図 1) のシーケンスでのみ最小限の傷跡を残して、ある特定の遺伝子のコーディング シーケンスの完全な削除を実現できます。
わずか 10 年前、いわゆる慶應義塾コレクションが開発されました。ほぼすべての非本質的な遺伝子が λ 赤組換え7,8によって削除された個別に標準検査大腸菌K12 株に基づく細菌ライブラリです。このコレクションの各内のクローンは、物品税課税対象の菅抵抗カセットに置き換えられます 1 つのコーディング シーケンスを持っています。慶應コレクションは、多くのアプリケーション9便利なツールを証明しています。そのようなアプリケーションは、他の大腸菌の欠失変異株の生産です。特定削除クローンから菅カセットは、バクテリオファージ P110、11,12,13,14などを一般に伝達によって動員することができます。そのようなストレスから調製したファージ株式使用できます受信者、関心の大腸菌に感染する、低いが信頼性の高い周波数菅でカセットを含む地域に組み込むことが受信者のゲノムの相同組み換えによる(図 2)。菅含有培地で成長形質を選択できます。この後、抗生物質耐性カセットの除去が必要な場合、FLP リコンビナーゼはトランスで transductant 株に指定できます。抵抗、アンピシリン (Amp) のマーカーを運ぶ、FLP を含むプラスミドを硬化後、菅とアンプに敏感なクローンを上映するほか、正しい切除野生型のコーディング シーケンスと菅カセットはコロニー PCR によって確認されます。
ここでは、ノックアウト上記戦略に基づく大腸菌の菌株の生産のステップのそれぞれを記述する詳細なプロトコルが表示されます。例として、多摩遺伝子の削除が示されています。多摩は、アセンブリ モジュール (TAM)、特定の細胞蛋白質と線毛15,16,17の生合成に関与する輸送の一部である外膜 β バレル型タンパク質をエンコードします。このノックアウトのひずみを 2 つの三量体細胞アドヘシン (TAAs)、エルシニア双球菌矢田、エシェリヒア属大腸菌免疫グロブリン (Ig) の器官に多摩の削除の影響を調べる使用して-バインド TAA EibD18,19。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BW25113</td><td>NIG</td><td>ME6092</td><td>Wild-type strain of Keio collection</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21(DE3)</td><td>Merck</td><td>69450-3</td><td>Expression strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21DABCF</td><td>Addgene</td><td>102270</td><td>Derived from BL21(DE3)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; JW4179</td><td>NIG</td><td>JW4179-KC</td><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; deletion mutant</td></tr><tr><td>P1 &lt;em&gt;vir&lt;/em&gt;</td><td>NIG</td><td>HR16</td><td>Generally transducing bacteriophage</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plasmids&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCP20</td><td>CGSC</td><td>14177</td><td>conditionally replicating plasmid with FLP</td></tr><tr><td>pASK-IBA2</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1301-000</td><td>expression vector</td></tr><tr><td>pEibD10</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>for production of EibD; plasmid available on request</td></tr><tr><td>pET22b+</td><td>Merck</td><td>69744-3</td><td>expression vector</td></tr><tr><td>pIBA2-YadA</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>for production of YadA; plasmid available on request</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>ThermoFisher</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Applichem</td><td>A0839</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline</td><td>Abcam</td><td>ab145350</td><td></td></tr><tr><td>anti-collagen type I antibody COL-1</td><td>Sigma</td><td>C2456</td><td></td></tr><tr><td>Bovine collagen type I</td><td>Sigma</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Di-sodium hydrogen phosphate</td><td>VWR</td><td>28029</td><td></td></tr><tr><td>DNA dye</td><td>Thermo</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>DNA molecular size marker</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>ECL HRP substrate</td><td>Advansta</td><td>K-12045</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>24388</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit IgG-HRP</td><td>Agrisera</td><td>AS10668</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>30487</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl thiogalactoside</td><td>VWR</td><td>43714</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Applichem</td><td>A4972</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>VWR</td><td>25108</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-lauroyl sarcosine</td><td>Sigma</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk powder</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>VWR</td><td>27808</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; forward primer</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5&#039;-GAAAAAAGG&lt;br /&gt;ATATTCAGGAGAAAATGTG-3&#039;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tamA&lt;/em&gt; reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td>Sequence 5&#039;-TCATAATT&lt;br /&gt;CTGGCCCCAGACC-3&#039;</td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>VWR</td><td>84610</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Merck</td><td>103753</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis chamber</td><td>Hoefer</td><td>SUB13</td><td></td></tr><tr><td>Bead beater</td><td>Thermo</td><td>FP120A-115</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Kodak</td><td>4000R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2089</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation unit</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>Gel imager</td><td>Nippon Genetics</td><td>GP-03LED</td><td></td></tr><tr><td>Incubating shaker</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>VWR</td><td>390-0482</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Microwave oven</td><td>Samsung</td><td>CM1099A</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Biometra</td><td>Tpersonal</td><td></td></tr><tr><td>PCR strips</td><td>Axygen</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2211-01</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>ThermoFisher</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAG electrophoresis chamber</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06322</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>GFL</td><td>D3006</td><td></td></tr><tr><td>Wet transfer unit</td><td>Hoefer</td><td>TE22</td><td></td></tr></tbody></table>

producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes

細菌の未知遺伝子の機能を勉強する最初のアプローチは、この遺伝子のノックアウトを作成することです。ここでは、バクテリオファージ P1 と一般化伝達を使用して別に 1 つのエシェリヒア属大腸菌の緊張から遺伝子欠失変異体を転送するための堅牢で高速なプロトコルについて述べる。このメソッドは、変異が選択可能な (例えば、抗生物質のカセット挿入を使用して遺伝子破壊に基づく) にする必要があります。このような抗生物質のカセット ドナーひずみから動員できる興味の受信者にすばやく導入し、遺伝子失変異を簡単に生成します。抗生物質のカセットは、ゲノムのシーケンスでのみ 〜 100 ベース ペア長い傷跡きれいなノックアウトを生成するサイト固有のリコンビナーゼによってカセットの切除ができる flippase の認識部位を含むように設計できます。プロトコルを示す細胞の生合成に関与するアセンブリ因子多摩遺伝子をノックアウトし、器官にこのノックアウトの効果と 2 つの三量体細胞アドヘシンの機能をテストします。P1 伝達によって遺伝子の欠失は、その制限があります、使いやすさとその実装の速度は、遺伝子欠失の他の方法に代わる。

BL21ΔABCF のノックアウトから多摩の生成:
上記の戦略は、BL21(DE3) で、外膜タンパク質の生産用に最適化され、BL21ΔABCF21と呼ばれるタンパク質の生産に使用される標準的な実験室ひずみのデリバティブ歪みを生成する以前使用されています。この株は、豊富な外膜蛋白質のために符号化する 4 つの遺伝?...

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Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

ここで他の大腸菌の欠失変異株を作るための基盤として、既存の抗生物質抵抗カセット削除構造の使用のためのプロトコルを提案する.このような欠失変異体を動員し、P1 ファージ伝達を使用して受信者負担の対応する軌跡に挿入することができます。

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

17.0K ビュー.  University of Oslo. ここで他の大腸菌の欠失変異株を作るための基盤として、既存の抗生物質抵抗カセット削除構造の使用のためのプロトコルを提案する.このような欠失変異体を動員し、P1 ファージ伝達を使用して受信者負担の対応する軌跡に挿入することができます。

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Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

生物工学

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

抗生物質耐性の進化のマルチコピー プラスミドのロールのテスト

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

遺伝学

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

実験的進化論におけるプラスミド媒介抗生物質耐性の定量化

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

免疫・感染学

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

生物学

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in elucidating the mechanisms that C. trachomatis use to create and maintain a privileged intracellular niche has been limited due to a lack of genetic tools. Fortunately, there have recently been several new advances in genetic manipulation techniques. Among these is the development of fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis (FRAEM). This method allows targeted gene deletion coupled with insertion of a selection cassette encoding antibiotic resistance and green fluorescent protein (GFP). Reliance on this strategy can be complicated when targeting genes within polycistronic operons due to the potential of polar effects on downstream genes. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), the protocol for which is described here, was developed to alleviate cassette-induced polar effects. FLAEM utilizes Cre-loxP genome editing to remove the selection cassette after targeted deletion by allelic exchange. The resulting strains contain markerless gene deletions of one or more coding sequences. This technique facilitates direct assessment of gene function and expands the repertoire of tools for genetic manipulation in C. trachomatis.

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Described here is a method for targeted, markerless gene deletion in Chlamydia trachomatis using floxed cassette allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

の世代<em&gt;エンテロバクター</em&gt;エスピー。 YSU要求株にはトランスポゾン突然変異誘発を用いて

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

RNA-mediated knockdowns are widely used to control gene expression. This versatile family of techniques makes use of short RNA (sRNA) that can be synthesized with any sequence and designed to complement any gene targeted for silencing. Because sRNA constructs can be introduced to many cell types directly or using a variety of vectors, gene expression can be repressed in living cells without laborious genetic modification. The most common RNA knockdown technology, RNA interference (RNAi), makes use of the endogenous RNA-induced silencing complex (RISC) to mediate sequence recognition and cleavage of the target mRNA. Applications of this technique are therefore limited to RISC-expressing organisms, primarily eukaryotes. Recently, a new generation of RNA biotechnologists have developed alternative mechanisms for controlling gene expression through RNA, and so made possible RNA-mediated gene knockdowns in bacteria. Here we describe a method for silencing gene expression in E. coli that functionally resembles RNAi. In this system a synthetic phagemid is designed to express sRNA, which may designed to target any sequence. The expression construct is delivered to a population of E. coli cells with non-lytic M13 phage, after which it is able to stably replicate as a plasmid. Antisense recognition and silencing of the target mRNA is mediated by the Hfq protein, endogenous to E. coli. This protocol includes methods for designing the antisense sRNA, constructing the phagemid vector, packaging the phagemid into M13 bacteriophage, preparing a live cell population for infection, and performing the infection itself. The fluorescent protein mKate2 and the antibiotic resistance gene chloramphenicol acetyltransferase (CAT) are targeted to generate representative data and to quantify knockdown effectiveness.

Phage-mediated Delivery of Targeted sRNA Constructs to Knock Down Gene Expression in E. coli

We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

要約

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サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

抗生物質耐性の進化のマルチコピープラスミドのロールのテスト

実験的進化論におけるプラスミド媒介抗生物質耐性の定量化

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング

ゲノムワイドな遺伝子欠失で

緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

の世代

ターゲティングされたのsRNAのファージ媒介送達はにおける遺伝子発現をノックダウンするために構築します

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

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サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

抗生物質耐性の進化のマルチコピー プラスミドのロールのテスト

実験的進化論におけるプラスミド媒介抗生物質耐性の定量化

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング

ゲノムワイドな遺伝子欠失で

緑膿菌におけるフレーム内遺伝子欠失変異体の生成と感染の単純マウスモデルにおける毒性減衰の試験

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

の世代

ターゲティングされたのsRNAのファージ媒介送達はにおける遺伝子発現をノックダウンするために構築します

抗生物質耐性の進化のマルチコピープラスミドのロールのテスト