慶應コレクション系統は、ナショナルバイオ リソース プロジェクト (遺伝研, 日本) から得られた:エシェリヒア属大腸菌。彼の継続サポートありがとうダーク リンケ (バイオ サイエンス学科、オスロ大学)。この作品は、ノルウェー若手研究者グラント 249793 (ジャック C. レオ) に研究評議会によって賄われていた。

1 系統とプラスミド
<ol><li>
細菌の緊張
	<ol>
<li>大腸菌株 BW251135JW4179 (BW25113 tamA::kan)7、BL21(DE3)20、および BL21ΔABCF21を使用します。詳細については、材料の表を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
バクテリオファージ
	<ol>
<li>一般的な伝達にバクテリオファージ P1virを使用します。クロロホルムを数滴の液体在庫としてバクテリオファージを格納 (手順 2.2 参照)。詳細については、材料の表を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
プラスミド
	<ol>
<li>このプロトコルでは、次のプラスミドを使用: pCP2022、pIBA2 矢田23、および24pEibD10。制御プラスミドとして pASK IBA2 と pET22b (材料の表を参照) を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
成長の条件
	<ol>
<li>ホストゲノム スープ (LB) 中25 37 ° C または BL21ΔABCF と pCP20 を含む系統の場合 30 ° C で活発な動揺 (180-200 rpm) の中の細菌に伝達します。</li>
		<li>43 ° C で硬化性プラスミドを実行します。</li>
		<li>固体培地の寒天 1% (w/v) ポンドを補足します。</li>
		<li>上の寒天の 0.7% 寒天と 10 mM CaCl2とオートクレーブ中で LB を補足します。エレクトロポレーション26後回復のため SOC 培地を使用します。</li>
		<li>抗生物質のため下記の濃度を使用: アンプと菅の 25 μ g/mL の 100 μ g/mL</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 ファージ Lysate を準備します。
<ol><li>
ドナー株の感染
	<ol>
<li>5 mL の LB 培 10 mM CaCl2とし、必要に応じて菅でドナー株 JW4197 を成長 (25 μ g/mL) 600 の光学濃度に 〜 1.0 nm (外径600)。分光光度計を用いた OD600の値を測定します。</li>
		<li>LB 培地で既存の P1 バクテリオファージ株式の希釈系列を作る: 10-3 10-7~ 間の希釈を推奨します。</li>
		<li>細菌懸濁液と与えられたファージ希釈 15 mL 遠心管またはそれと同等の 100 μ L のミックス 200 μ L。バクテリオファージ希釈として多くのチューブを用意します。振ることがなく 37 ° C で 20 分間チューブを孵化させなさい。</li>
		<li>チューブに 10 mM CaCl2を添加した溶の上の寒天 (~ 50 ° C) 〜 3 mL を加えてミックス内容に徹底的にボルテックス チューブ、まもなくも層を作る prewarmed LB プレートの上に混合物を注ぐ。</li>
		<li>37 ° C で一晩版を孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ライセート作製
	<ol>
<li>次の日は、バクテリオファージのプラクの半合流成長とプレートを選択します。半合流プレートの約半分の表面積プレートは明らか (図 3)。</li>
		<li>接種ループまたは同様のツールを使用してこのようなプレートから上の寒天層をこすり、遠心管中上の寒天を配置します。ヒューム フードの LB の 1-2 mL とクロロホルムと渦 ~ 1 分追加、クロロホルムは積極的にチューブのドロップを追加します。</li>
		<li>寒天と菌体ペレットへ 4,000 g以上で 15 分の管を遠心します。</li>
		<li>ペレットからの残骸の上に運ぶ回避する新鮮な遠心チューブに上清を移動します。クロロホルムの 2 滴を追加し、4-10 ° c. でライセートを格納ヒューム フードのクロロホルムを追加します。これは伝染性の粒子の数の大幅な削減になりますので、ライセートすぎるバクテリオファージは凍結しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
溶解液の力価を決定します。
	<ol>
<li>37 ° C で 10 mM CaCl2文化 〜 1.0 の外径 φ600まで添加した LB の BW25113 に成長します。</li>
		<li>LB (例えば、10-6– 10-9) の lysate のバクテリオファージの希釈系列を調製します。 注: 必ずピペット、サンプルを希釈するクロロホルムの転送を避けるために lysate の上から。</li>
		<li>細菌懸濁液と与えられたファージ希釈 15 mL 遠心管またはそれと同等の 100 μ L のミックス 200 μ L。バクテリオファージ希釈として多くのチューブを用意します。振ることがなく 37 ° C で 20 分間チューブを孵化させなさい。</li>
		<li>チューブに 10 mM CaCl2を添加した溶の上の寒天 (~ 50 ° C) 〜 3 mL を加えてミックス内容に徹底的にボルテックス チューブ、まもなくも層を作る prewarmed LB プレートの上に混合物を注ぐ。</li>
		<li>37 ° C で一晩版を孵化させなさい</li>
		<li>次の日は、各プレートのプラーク (細菌のマットで明確な地域) の数をカウントし、次の数式を使用して、溶解液の力価を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq1.jpg"> 例: 希釈 10-7, 10-810-9とプレートにあり 231、27、2 プラク、それぞれ。感染症の各希釈 100 μ L を用いてプラーク形成力価が表されるので、単位 (pfu)/mL、めっき因子は 10。これらの数値は、数式に入力されます。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq2.jpg"> したがって、力価は約 2 × 1010伝染性のバクテリオファージの粒子/mL です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. P1 伝達
<ol><li>
受信者のセルの準備
	<ol>
<li>600 の光学濃度に添加した LB の受信者株 BL21ΔABCF を成長 〜 1.0 nm (外径600)。分光光度計を使用して、外径 φ600の値を測定します。</li>
		<li>ライセートのバクテリオファージの感染 (MOI) 値が 0.5 の多様性を達成するために必要なボリュームを計算します。慣性モーメントを計算するには、文化の OD600に基づいて細菌の数を見積もる。外径600値 1.0 が 10 〜9 cfu/mL に対応することを想定してください。ライセートの知られている力価に基づいて必要な容量を計算します。 (2.3.6 の手順の後の例で計算力価に基づく) の例: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58267/58267eq3.jpg">
</li>
		<li>10 mm 受信者ひずみ文化に CaCl2を加え、混ぜます。文化伝達のための 1 mL を取る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
伝達を行う
	<ol>
<li>3.1.2 のステップで計算される (CaCl2 10 mm 含む) 受信者の文化の 1 mL に溶解バクテリオファージの適切なボリュームを追加、軽く混ぜます。 注: は、ミックスにクロロホルムを転送しないようにするライセートの上からサンプルをピペットように注意します。</li>
		<li>37 ° C で 20 分のミックスを静的にインキュベートします。</li>
		<li>100 mm pH 5.5、クエン酸ナトリウムを追加することによって感染を停止します。</li>
		<li>細菌 (5,000 × gを 2 分間) を遠心し、上清を除去、100 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.5 と補われる新鮮な LB の 1 mL でそれらを再懸濁します。</li>
		<li>3.2.4 無料ファージとカルシウムの除去を確保するためのステップのようにさらに 2 回細胞を洗浄します。</li>
		<li>100 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.5 と補われる新鮮な LB の 1 mL 中の細菌を再懸濁します。30 ° C (> 100 rpm) の揺れで 1 h で細菌を孵化させなさい。</li>
		<li>遠心分離 (5,000 × gを 2 分間) によって細菌を収集し、100 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.5 の LB の ~ 100 μ L でそれらを再懸濁します。</li>
		<li>25 μ g/mL と 10 mM クエン酸ナトリウム、pH 5.5、菅と補われる LB プレートに細菌を広げるし、植民地 (~ 24 h) が表示されるまでに、30 ° C でバクテリアします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
形質を選択します。
	<ol>
<li>植民地選択板で育った、単一コロニーのためポンド + 菅にそれらを restreak、シングル コロニーが表示されるまで、30 ° C で成長します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 常套菅カセット
<ol><li>
組換えのプラスミッドの変形
	<ol>
<li>菅耐性 BL21ΔABCF ひずみ electrocompetent を確認します。<ol>
<li>菅首相は補われる新鮮な LB (5 mL) の単一コロニーから株を成長 (25 μ g/mL) 30 ° c まで OD600 ~0.5 – 0.7。</li>
			<li>ここから、4 ° c または氷の上、次の手順を実行します。細菌 (5,000 × gで 10 分間) を遠心し、上清を除去します。</li>
			<li>2 回前の遠心分離のステップを繰り返すことによって冷たい蒸留水細胞ペレットを洗浄し、最後に、氷冷 10% グリセロールの 100 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>氷の上 1 mm エレクトロポレーション キュベットを冷やします。</li>
		<li>細胞懸濁液にプラスミド (pCP20) の 1 pg を追加、穏やか、懸濁液に混合し、冷却エレクトロポレーション キュベットに転送。</li>
		<li>本体を 1.8 に設定 kV および electroporate 細胞。</li>
		<li>SOC 培地 1 mL を追加し、30 ° C で 1 時間のそれらの成長によって変換されたセルを救出します。</li>
		<li>ポンド上のセルの 100 μ L をプレート + アンプ板し一晩 30 ° C で細胞を成長します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
再結合の誘導
	<ol>
<li>LB + アンプからシングル コロニーをピックアップ プレートし、すべての抗生物質を省略する新鮮な LB を接種します。</li>
		<li>FLP リコンビナーゼの発現を誘導するために一晩の非寛容な温度 (43 ° C) でセルを育てなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recombinants を選択します。
	<ol>
<li>シリアルの希薄を作ると非選択式ナンバー プレートに 105-106希釈の 50 μ L をプレートし、一晩 30 ° c. でそれを育てる</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 遺伝子欠失の検証
<ol><li>
成功した組換えプラスミドの損失の検証
	<ol>
<li>ストリーク プレート ステップ 4.3.1 LB + 菅、LB + アンプで準備からこの順序で、抗生物質がない LB プレート シングル コロニー。ストリー キングの支援するためコロニー グリッドを使用 (補足のファイル 1を参照してください)。植民地 (~ 24 h) が表示されるまで、30 ° C でプレートを成長します。</li>
		<li>非選択的プレート上に成長したが、さらに検証のための選択培地で成長に失敗しました 10-20 クローンを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
コロニー PCR による追加検証
	<ol>
<li>並ぶ多摩コーディング配列のプライマーとコロニー PCR を実行 (材料の表を参照してください)。</li>
		<li>PCR のマスターの組合せを準備します。必要なミックスは、(表 1の例を参照してください) テストするコロニーの数によって異なります。氷の試薬を混ぜて、最後ポリメラーゼを追加します。</li>
		<li>PCR マスター ミックスを混和し、PCR ストリップのチューブに 20 μ L を分注します。少量の滅菌ピペット チップを使用して上映される各コロニーをピックアップし、それをチューブに追加します。比較のため、元の受信者ひずみを含めるようにしてください。必要に応じて、ドナーの負担があります。</li>
		<li>PCR の反作用を実行 (使用プログラムの表 2を参照)。</li>
		<li>1% の agarose のゲルを準備します。<ol>
<li>50 mL ゲルの agarose の 0.5 g を測定し、50 mL の TAE バッファー (40 mM トリス、20 mM 酢酸と 1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) を追加します。すべて agarose が溶けるまで電子レンジでの混合物を加熱します。</li>
			<li>Agarose が解散後約 50 ° C にソリューションを冷却し、DNA 染色色素の 5 μ L を追加します。ソリューションをよく混合し、鋳造の部屋でゲル トレイにそれを注ぐ。すべてのサンプルを分子量マーカーの十分な井戸があります、よく櫛の 1 つまたは複数の行を挿入します。30 分に設定するゲルを許可します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>PCR の実行が完了すると、各サンプルに 4 μ L の DNA 読み込み染料 × 6 を追加します。ゲルの電気泳動室にし、井戸が覆われているまでに TAE バッファーを追加します。</li>
		<li>10-15 μ L をゲルの井戸に各 PCR の反作用から適用されます。分子量マーカーの 5 μ L を追加もできます。その後、75 V で 30 分のためのゲルを実行します。</li>
		<li>実行が完了すると、青の光の撮像素子を使用してゲルをイメージします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. その他のテクニック
<ol><li>
蛋白質の表現 注: テスト蛋白質 (矢田・ EibD) の表情をしています23,24詳細他の場所で説明されています。これは、主な手順の概要です。<ol>
<li>BL21ΔABCF Δ多摩 wi 番目に必要なプラスミド (pIBA2 矢田と pEibD10 と対応する制御プラスミド) を変換し、LB + アンプの形質転換体の選択。</li>
		<li>蛋白質の表現のため一晩培養変形中の 1 mL の LB 培地 + アンプの 100 mL を接種してその時点での中間ログ段階まで 30 ° C で栽培、(100 ng/mL) でいずれかの anhydrotetracycline を持つ蛋白質の生産を誘発するか(0.5 mM) でイソプロピル thiogalactoside。</li>
		<li>30 ° C で誘導の 2 h 文化の濁度を測定し、OD600で 50 mL に対応するセルの数を収集した後は、4,000 x gで 15 分間文化を遠心分離によって 1.0 を = します。餌を洗浄 1 x 10 mm HEPES、pH 7.4 では、し、いずれかは-20 ° C またはプロセス ステップ 6.2 のようにさらにそれでそれを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
外膜抽出 メモ: 外膜抽出は実行されますレオらによって詳細に説明されているよう27. 主な手順を以下に記載します。<ol>
<li>10 mm HEPES、pH 7.4 では、1 mL の細胞ペレットを再懸濁します補足 10 mM MgCl2と MnCl2リゾチーム (0.1 mg/mL)、DNase のピンチと私。</li>
		<li>(例えばビード ・ ビーターを使用して) 細胞を溶解させます。</li>
		<li>細胞の残骸を削除し、新鮮なチューブに上清を移動直後のセル (15,600 x gで 2 分) を遠心します。</li>
		<li>16,000 x gで 30 分間細胞を遠心分離後、1 %n ラウロイル サルコシン 10 mM HEPES、pH 7.4 の 400 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
		<li>その後、室温で 30 分間撹拌で細胞をインキュベート、上記として 30 分のそれらを遠心分離機します。</li>
		<li>洗って、半透明ペレットを 10 mM HEPES、pH 7.4 では、200 μ l 1 x 10 mM HEPES の 30 μ L でそれを再懸濁します、4 x SDS-PAGE サンプルバッファーの 10 μ L を追加。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
活性測定法 注: は、として記述されている28矢田と EibD の SDS-PAGE と活性アッセイを実行します。主な手順は以下のとおり。</li>
	<li>
SDS ページ
	<ol>
<li>5 分の 50 ° c のサンプルを加熱すると、タンパク質の変性を避けるために、ポリアクリルアミドのゲルにロードする前に。</li>
		<li>SDS ページの分離、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜に蛋白質を転送します。</li>
		<li>転送後、PBS で 2% 脱脂ミルク パウダーと膜をブロックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
矢田コラーゲン遠い西部のしみ方
	<ol>
<li>ブロック後、10 μ g/mL の濃度にブロック バッファーで希釈私牛由来のコラーゲンの種類を追加、1 h の膜を孵化させなさい。</li>
		<li>2 膜を洗浄する PBS + 0.05% Tween20 x (PBS-T)。</li>
		<li>ブロック バッファー内膜に一次抗体 (モノクローナル抗コラーゲン COL 1)、希薄化後の 1:2,000 を追加します。</li>
		<li>1 h の膜をインキュベート後ステップ 6.3.2.2 で述べたように 2 x を洗浄し、ブロック バッファーで希釈 1: 10,000、二次抗体 [ヤギ抗マウス IgG 西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 共役] を追加します。</li>
		<li>1 h の膜をインキュベートして洗って PBS T で 2 倍製造元の指示に従って膜強化化学発光基質を追加し、CCD カメラを使用してバンドを検出します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
EibD IgG 結合の試金
	<ol>
<li>後に、ブロック (ヤギ抗うさぎ HRP)、二次抗体希釈バッファーの妨害に 1:2,000 を追加します。</li>
		<li>1 h の膜をインキュベートして洗って PBS で 2 倍。前述のステップ 6.3.2.5 化学ルミネセンスの検出を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blount, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unexhausted+potential+of+E.+coli.">The unexhausted potential of E. coli.</a> eLife. 4, e05826 (2015).</li><li>Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+for+generating+deletions+and+gene+replacements+in+Escherichia+coli.">New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-4622 (1989).</li><li>Link, A. J., Phillips, D., Church, G. 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C., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunoglobulin-binding+Eib+proteins+from+Escherichia+coli+are+receptors+for+IgG+Fc.">The immunoglobulin-binding Eib proteins from Escherichia coli are receptors for IgG Fc.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1860-1866 (2009).</li><li>M&#252;hlenkamp, M., Oberhettinger, P., Leo, J. C., Linke, D., Sch&#252;tz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+adhesin+A+(YadA)+-+Beauty+&amp;+beast.">Yersinia adhesin A (YadA) - Beauty &amp; beast.</a> International Journal of Medical Microbiology. 305 (2), 252-258 (2015).</li><li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes.">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).</li><li>Meuskens, I., Michalik, M., Chauhan, N., Linke, D., Leo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strain+collection+for+improved+expression+of+outer+membrane+proteins.">A new strain collection for improved expression of outer membrane proteins.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 464 (2017).</li><li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+in+Escherichia+coli:+TcR+and+KmR+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant.">Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li><li>Grosskinsky, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+glycine+residue+of+trimeric+autotransporter+domains+plays+a+key+role+in+Yersinia+adhesin+A+autotransport.">A conserved glycine residue of trimeric autotransporter domains plays a key role in Yersinia adhesin A autotransport.</a> Journal of Bacteriology. 189 (24), 9011-9019 (2007).</li><li>Leo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+E.+coli+IgG-binding+protein+D+suggests+a+general+model+for+bending+and+binding+in+trimeric+autotransporter+adhesins.">The structure of E. coli IgG-binding protein D suggests a general model for bending and binding in trimeric autotransporter adhesins.</a> Structure. 19 (7), 1021-1030 (1993).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+lysogenesis.+I.+The+mode+of+phage+liberation+by+lysogenic+Escherichia+coli.">Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Leo, J. C., Oberhettinger, P., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+outer+membrane+insertion+and+folding+of+multimeric+transmembrane+&#946;-barrel+proteins.">Assessing the outer membrane insertion and folding of multimeric transmembrane &#946;-barrel proteins.</a> Methods in Molecular Biology. , 157-167 (2015).</li><li>Mikula, K. M., Leo, J. C., &#321;yskowski, A., Kedracka-Krok, S., Pirog, A., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translocation+domain+in+trimeric+autotransporter+adhesins+is+necessary+and+sufficient+for+trimerization+and+autotransportation.">The translocation domain in trimeric autotransporter adhesins is necessary and sufficient for trimerization and autotransportation.</a> Journal of Bacteriology. 194 (4), 827-838 (2012).</li><li>Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+genome+manipulation+by+P1+transduction.">E. coli genome manipulation by P1 transduction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2007).</li><li>Franklin, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+in+gal+U+gene+of+E.+coli+blocks+phage+P1+infection.">Mutation in gal U gene of E. coli blocks phage P1 infection.</a> Virology. 38 (1), 189-191 (1969).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequences+of+Escherichia+coli+B+strains+REL606+and+BL21(DE3).">Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3).</a> Journal of Molecular Biology. 394 (4), 644-652 (2009).</li><li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Alignment+during+Homologous+Recombination.">DNA Sequence Alignment during Homologous Recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (22), 11572-11580 (2016).</li><li>Watt, V. M., Ingles, C. J., Urdea, M. S., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology+requirements+for+recombination+in+Escherichia+coli.">Homology requirements for recombination in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (14), 4768-4772 (1985).</li><li>Ho, T. D., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterohemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7+gal+mutants+are+sensitive+to+bacteriophage+P1+and+defective+in+intestinal+colonization.">Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 gal mutants are sensitive to bacteriophage P1 and defective in intestinal colonization.</a> Infection and Immunity. 75 (4), 1661-1666 (2006).</li><li>Ikeda, H., Tomizawa, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transducing+fragments+in+generalized+transduction+by+phage+P1.+I.+Molecular+origin+of+the+fragments.">Transducing fragments in generalized transduction by phage P1. I. Molecular origin of the fragments.</a> Journal of Molecular Biology. 14 (1), 85-109 (1965).</li><li>Murooka, Y., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+the+host+range+of+coliphage+P1+and+gene+transfer+from+enteric+bacteria+to+other+Gam-negative+bacteria.">Expansion of the host range of coliphage P1 and gene transfer from enteric bacteria to other Gam-negative bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 38 (4), 754-757 (1979).</li><li>Goldberg, R. B., Bender, R. A., Streicher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+selection+for+P1-sensitive+mutants+of+enteric+bacteria.">Direct selection for P1-sensitive mutants of enteric bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 118 (3), 810-814 (1974).</li><li>O'Connor, K. A., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coliphage+P1-mediated+transduction+of+cloned+DNA+from+Escherichia+coli+to+Myxococcus+xanthus:+use+for+complementation+and+recombinational+analyses.">Coliphage P1-mediated transduction of cloned DNA from Escherichia coli to Myxococcus xanthus: use for complementation and recombinational analyses.</a> Journal of Bacteriology. 155 (1), 317-329 (1983).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

P1 伝達は、エシェリヒア属大腸菌の遺伝子の削除を生成するための高速、堅牢で、信頼性の高い方法です。BL21 由来の受信者に慶應義塾ドナーひずみから多摩失変異を伝達でここでこれを示します。伝達プロセスの主要な段階は、ライセートの生産、伝達自体、菅抵抗カセットの切除および PCR によるノック アウトの検証です。合計では、プロセスは約 1 週間ほどかかります、?...

遺伝子の機能を検討する共通の最初のアプローチは、ノックアウト変異を実行し、結果の表現型を観察することです。これはまた逆遺伝学と呼ばれます。最後の 70 年間またはそう、その培養と遺伝子操作1こうして容易なため細菌エシェリヒア属大腸菌分子生物学の主力となっています。エシェリヒア属大腸菌、マーカー交換変異2,3と、最近では、λ 赤または Rac ET システム4,5を使用してジーンを含む遺伝子の削除を生成するいくつかの方法が開発されています。,6。
広く使われているシステムでは、個々 の遺伝子のコード配列が染色体5,7から後で摘出することができます抗生物質耐性カセットに置き換えられます。いずれかの側に flippase (FLP) 認識対象 (FRT) サイトが並ぶされているカナマイシン (菅) 抵抗カセットによって例えばコーディング シーケンスが置き換えられます。FRT サイトは菅カセットの削除につながる FRT サイト間の部位特異的組換えを媒介する FLP リコンビナーゼによって認識されます。この方法で、約 100 塩基対 (bp) (図 1) のシーケンスでのみ最小限の傷跡を残して、ある特定の遺伝子のコーディング シーケンスの完全な削除を実現できます。
わずか 10 年前、いわゆる慶應義塾コレクションが開発されました。ほぼすべての非本質的な遺伝子が λ 赤組換え7,8によって削除された個別に標準検査大腸菌K12 株に基づく細菌ライブラリです。このコレクションの各内のクローンは、物品税課税対象の菅抵抗カセットに置き換えられます 1 つのコーディング シーケンスを持っています。慶應コレクションは、多くのアプリケーション9便利なツールを証明しています。そのようなアプリケーションは、他の大腸菌の欠失変異株の生産です。特定削除クローンから菅カセットは、バクテリオファージ P110、11,12,13,14などを一般に伝達によって動員することができます。そのようなストレスから調製したファージ株式使用できます受信者、関心の大腸菌に感染する、低いが信頼性の高い周波数菅でカセットを含む地域に組み込むことが受信者のゲノムの相同組み換えによる(図 2)。菅含有培地で成長形質を選択できます。この後、抗生物質耐性カセットの除去が必要な場合、FLP リコンビナーゼはトランスで transductant 株に指定できます。抵抗、アンピシリン (Amp) のマーカーを運ぶ、FLP を含むプラスミドを硬化後、菅とアンプに敏感なクローンを上映するほか、正しい切除野生型のコーディング シーケンスと菅カセットはコロニー PCR によって確認されます。
ここでは、ノックアウト上記戦略に基づく大腸菌の菌株の生産のステップのそれぞれを記述する詳細なプロトコルが表示されます。例として、多摩遺伝子の削除が示されています。多摩は、アセンブリ モジュール (TAM)、特定の細胞蛋白質と線毛15,16,17の生合成に関与する輸送の一部である外膜 β バレル型タンパク質をエンコードします。このノックアウトのひずみを 2 つの三量体細胞アドヘシン (TAAs)、エルシニア双球菌矢田、エシェリヒア属大腸菌免疫グロブリン (Ig) の器官に多摩の削除の影響を調べる使用して-バインド TAA EibD18,19。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BW25113</td>
			<td>NIG</td>
			<td>ME6092</td>
			<td>Wild-type strain of Keio collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21(DE3)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>69450-3</td>
			<td>Expression strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21DABCF</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>102270</td>
			<td>Derived from BL21(DE3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli JW4179</td>
			<td>NIG</td>
			<td>JW4179-KC</td>
			<td>tamA deletion mutant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1 vir</td>
			<td>NIG</td>
			<td>HR16</td>
			<td>Generally transducing bacteriophage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCP20</td>
			<td>CGSC</td>
			<td>14177</td>
			<td>conditionally replicating plasmid with FLP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pASK-IBA2</td>
			<td>IBA GmbH</td>
			<td>2-1301-000</td>
			<td>expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEibD10</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for production of EibD; plasmid available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET22b+</td>
			<td>Merck</td>
			<td>69744-3</td>
			<td>expression vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pIBA2-YadA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>for production of YadA; plasmid available on request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>33209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Bacto</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anhydrotetracycline</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab145350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type I antibody COL-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2456</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine collagen type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>102445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA dye</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA molecular size marker</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3232S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL HRP substrate</td>
			<td>Advansta</td>
			<td>K-12045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>24388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Agrisera</td>
			<td>AS10668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl thiogalactoside</td>
			<td>VWR</td>
			<td>43714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-lauroyl sarcosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>70166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamA forward primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence 5&#39;-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tamA reverse primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequence 5&#39;-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>84610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel electrophoresis chamber</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>SUB13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead beater</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>FP120A-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>4000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation unit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1652100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>GP-03LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubating shaker</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>390-0482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>CM1099A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>Tpersonal</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR strips</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-0208-CP-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Hanna Instruments</td>
			<td>HI2211-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAG electrophoresis chamber</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A25977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B06322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>GFL</td>
			<td>D3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet transfer unit</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>TE22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

producing gene deletions in escherichia coli by p1 transduction with excisable antibiotic resistance cassettes

細菌の未知遺伝子の機能を勉強する最初のアプローチは、この遺伝子のノックアウトを作成することです。ここでは、バクテリオファージ P1 と一般化伝達を使用して別に 1 つのエシェリヒア属大腸菌の緊張から遺伝子欠失変異体を転送するための堅牢で高速なプロトコルについて述べる。このメソッドは、変異が選択可能な (例えば、抗生物質のカセット挿入を使用して遺伝子破壊に基づく) にする必要があります。このような抗生物質のカセット ドナーひずみから動員できる興味の受信者にすばやく導入し、遺伝子失変異を簡単に生成します。抗生物質のカセットは、ゲノムのシーケンスでのみ 〜 100 ベース ペア長い傷跡きれいなノックアウトを生成するサイト固有のリコンビナーゼによってカセットの切除ができる flippase の認識部位を含むように設計できます。プロトコルを示す細胞の生合成に関与するアセンブリ因子多摩遺伝子をノックアウトし、器官にこのノックアウトの効果と 2 つの三量体細胞アドヘシンの機能をテストします。P1 伝達によって遺伝子の欠失は、その制限があります、使いやすさとその実装の速度は、遺伝子欠失の他の方法に代わる。

BL21ΔABCF のノックアウトから多摩の生成:
上記の戦略は、BL21(DE3) で、外膜タンパク質の生産用に最適化され、BL21ΔABCF21と呼ばれるタンパク質の生産に使用される標準的な実験室ひずみのデリバティブ歪みを生成する以前使用されています。この株は、豊富な外膜蛋白質のために符号化する 4 つの遺伝?...

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Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

ここで他の大腸菌の欠失変異株を作るための基盤として、既存の抗生物質抵抗カセット削除構造の使用のためのプロトコルを提案する.このような欠失変異体を動員し、P1 ファージ伝達を使用して受信者負担の対応する軌跡に挿入することができます。

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

16.9K ビュー.  University of Oslo. ここで他の大腸菌の欠失変異株を作るための基盤として、既存の抗生物質抵抗カセット削除構造の使用のためのプロトコルを提案する.このような欠失変異体を動員し、P1 ファージ伝達を使用して受信者負担の対応する軌跡に挿入することができます。

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Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

遺伝学

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

QTLマッピングとCRISPR / Cas9編集による薬剤耐性遺伝子同定<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

抗生物質耐性の進化のマルチコピー プラスミドのロールのテスト

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

多重遺伝子型及び質量分析法と臨床コホート研究でテスト候補遺伝子

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

実験的進化論におけるプラスミド媒介抗生物質耐性の定量化

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...