Bu yöntemin genel amacı, dokuya özgü bir hedefli ifade sistemi oluşturmaktır. Bu yöntemde, bizim Drosophila FGF homolog, dalsız özel bir ikili transkripsiyonel sürücü nesil gösterdi. Dalsızın dinamik, spatiotemporal ekspresyonu trakeal hava yolu epitelinin dal hemogenezini düzenler.
Bu yöntem, dalsız üretim hücrelerinin spatiotemporal ekspresyonu ve göçü hakkında bilgi sağlasa da, Drosophila'daki diğer gen ve dokulara veya C.Elegans ve zebra balığı gibi diğer model organizmalara kolayca uygulanabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, son derece güvenilir, doku ve gen özgü ve sadece değiştirilen genin cis düzenleyici elemanlarının işlevsel olduğu hücrelerde aktif ekspresyon sistemleri oluşturmasıdır. İkili transkripsiyon sistemleri hedeflenen gen ekspresyonu ve manipülasyonu için gerekli araçlardır.
GAL4 veya LexA gibi bir trans aktivatör, bir genin cis düzenleyici unsurlarının kontrolü altında ifade, belirli transkripsiyon bağlayıcı sitelerin aşağı yerleştirilen bir efektör trans gen sürücü, GAL4 için UAS ve / veya LexO LexA gibi. Bu metodoloji, dalsız genin ilk kodlama exon'unun yerine transkripsiyon sürücüsünü ait olur. CRISPR Cas9 tabanlı yöntem, LexA trans aktivatör dizisini dalsız genin endojen düzenlemesi altına yerleştirir ve sonuç olarak trans aktivatör ekspresyonunu sadece dalsız spesifik spatiotemporal desenlerde kolaylaştırır.
Özellikle ilgi seçilen bölgenin iki ucunu hedefleyen iki kılavuz RNA hedef sitesi seçerek başlayın. CRISPR tasarım aracını açın. Fly CRISPR Optimal Target Finder burada kullanılmaktadır.
Select Genome'in ilgi sırasını seçin ve açılan menüde en son yüklenen Drosophila melanogaster genom açıklamasını seçin, şu anda R altı altını çizin. Ardından, kılavuz uzunluğu'nu seçin ve 20'yi girdi. Tüm CRISPR hedeflerini seçin ve CRISPR hedeflerini bul'u tıklatın.
Sıkılık ve NGG yalnızca PAM için maksimum ayarlayarak tüm aday kılavuzu RNA hedeflerini değerlendirin. Bir tandem kılavuzu RNA ifade vektörü oluşturmak için, ilk PCR bir DNA parçasını yükselterek iki proto spacer dizisini bir pCFD4 RNA ifade vektör omurgasına tanıtır. Her biri proto spacer sırasına sahip bir ileri ve geri astar kullanın ve yüksek sadakat polimeraz ve pCFD4 şablon DNA'sını kullanarak bir PCR'deki pCFD4 vektör dizisiyle örtüşün.
Klonlama için pCFD4 hazırlamak için, Bbs1 enzimi ile plazmid sindirin. 2-5 mikrogram pCFD4 plazmid ve bir mikrolitre Bbs1 enzimi ve 50 mikrolitrelik son hacmi içeren uygun sindirim tamponunda bir reaksiyon ayarlayın. Tüpü birbirine vurarak ve tüpün duvarından dibe doğru dağılmış tüm damlacıkları kısa bir dönüşle toplayarak reaksiyon içeriğini karıştırın.
REAKSIYON karışımını PCR ürününü çalıştırdıktan ve %1 agarose jel üzerinde sindirilmiş plazmidi çalıştırdıktan sonra iki saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Standart jel arıtma kolonları kullanarak 6.4 kilobase çifti lineer plazmid ve 600 baz çifti PCR ürün arındırın. ÜRETICInin protokolüne göre DNA montaj reaksiyonu ayarlayın.
GAL4 veya LexA dizisinin genomik knock-in için, trans aktivatör dizisi içeren bir çift telli HDR donör tasarımı, iki homoloji kollar tarafından çevrili. Kılavuz RNA'nın tasarlanmış çekirgeye yeniden hedeflemesini önlemek için, yedek vericiyi, kılavuz RNA tanıma sitelerinin tanıtılan eksojen dizi tarafından bozulacak şekilde tasarla. Ayrıca, cis düzenleyici öğelerin saflığını değiştirmemek için, kodlama ekson bölgesindeki kılavuz RNA tanıma sitelerini seçin.
Yeni bir kaset oluşturmak için, DNA montaj stratejisini dört parçayı bir araya getirmek üzere planlayın. Beş asal ve üç ana homoloji kolu, orta eksojen trans aktivatör DNA dizisi ve doğrusallaştırılmış klonlama vektör omurgası. PCR, uygun bir vektörden gal4 veya LexA ifade kasetini yükseltin ve PCR enjeksiyon için seçilen ana uçuç çizgisinden çıkarılan genomik DNA'dan homoloji kollarını güçlendirin.
Hedef parçaları oluşturmak için her PCR'de yüksek kaliteli polimeraz kullanın. DNA montaj reaksiyonunu ayarlamak için, PCR klonlama tarafından oluşturulan doğrusallaştırılmış klonlama vektörü ve hedef parçalarını DNA montaj mastermixi ve üreticinin talimatlarına göre 20 mikrolitreye son tepki hacmiile karıştırın. Reaksiyon karışımını 50 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.
Nos-Cas9 embriyoları daha önce hem kılavuz RNA ekspresyon plazmidi ve yedek donör ile enjekte, yetişkinler içine geliştirmek, çapraz G0 hedeflenen alel için uygun bir çizgiden sinekler dengelemek için ayrı ayrı uçar. Karbondioksit yastığı üzerinde her G0 çapraz F1 yavruları anestezi. Stereo mikroskop altında rastgele 10-20 erkek seçin.
Seçilen her erkeği, hedeflenen alel için uygun bir çizgiden dengeleyici bir kadına ayrı ayrı geçin. F2 larvaları yumurtadan çıktığında, her haçtan F1 babasını seçin. Her bir sineği bir pipet ucuyla 10 ila 15 saniye ezerek genomik DNA ayıklayın, tamponu dağıtmadan 50 mikrolitre ezme tamponu içeren.
Sonra, tüp içine kalan tampon dağıtmak ve iyice karıştırın. 37 derecede 20-30 dakika kuluçkaya yat. Kuluçkadan sonra tüpleri 95 derece Santigrat ısı bloğuna yerleştirin ve proteinaz K.'yi 10,000 kez g'de beş dakika eğdikten sonra, daha fazla PCR analizi için preparatı dört derece santigrat derecede saklayın.
Ekleme veya değiştirmenin varlığını ekrana kadar bir astar ileri ve ters bir şekilde kullanarak üç aşamalı PCR tabanlı ekranlar gerçekleştirin. Üç asal bölgeden ekleme veya değiştirme doğrulamak için ileri iki ve ters iki astar kullanarak PCR gerçekleştirin. AstarM13F kullanarak PCR gerçekleştirin ve ends-in'HDR kontrol etmek için üç ters.
Onaylanan ends-out'HDR ile sinek hatları tutun ve F2 nesil dengeli stokları kurmak. Dengeleyici diğer kromozomlar üzerinde istenmeyen mutasyonları kaldırmak için tekrar uçar. Dalsız, ya da bnl ekspresyonu, burada üçüncü instar larva kanat diskinde kırmızı renkte gösterilir, reseptör nefessiz ifade hücreleri ile, yeşil gösterilir, büyüyen hava kesesi primordium.
Dalsız ekspres hücreler burada TR5 enine bağ dalı ve TR2 dorsal dalında gösterilmiştir. Nefes siz ifade trakeal hücreleri burada yeşil gösterilir. Nefes siz ifade hücreleri yeşil olarak gösterilir, evre dokuzdan evre 14'e kadar gelişmekte olan embriyonik trakea işaretlenir ve dalsız ifade hücreleri kırmızı gösterilir.
Bu resim, kontrole göre hipoksik koşullar altında ektopik doku konumlarında indüklenen dalsız ifade gösterir. Bu yöntem, dalsız gen transkripsiyonunun tüm orijinal spatiotemporal düzenlemelerini korumak için tasarlanmıştır. Bu nedenle, genin sadece ilk kodlama exon'unun yerine LexA trans aktivatör kodlama dizisi koymak önemliydi.
Gelişiminden sonra, bu yeni genetik araç seti dalsız genin yeni doku ekspresyonu desenleri keşfetmek için yol açtı. Ayrıca gen yanlış ifade etkin ve sadece dalsız ifade hücreleri aşağı devirdi ve doğrusal göç izleme ve hücrelerin sinyal etkileşimleri yardımcı oldu.
