Bu yöntem, kardiyak güvenlik farmakolojisi alanındaki anahtar soruların cevapsız ına yardımcı olabilir. Örneğin, yeni bir insan ilacı normal kalp ritmini değiştirme riski taşır mı? Bu tekniğin en büyük avantajı, çok sayıda bileşimi hızlı ve orta bir maliyetle değerlendirebiliyor olmasıdır.
Prosedürü gösteren Camille Forny, laboratuvarımda araştırma görevlisi olacak. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin veya HIPSCCM'lerin sintiyak kasılmaları ölçümü için, iki dakika boyunca 37 derece santigrat su banyosunda dondurulmuş hücreler içeren CryoTubes yerleştirerek başlar. Her tüpten çözülmüş hücreli süspansiyonun tamamını tek bir tek, taze 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.
Kalan hücreleri almak için, her tüpü bir mililitre 37 derece santigrat önceden ısıtılmış kaplama ortamı ile yıkayın ve bu ortamı çözülmüş hücreler içeren 50 mililitrelik konik tüpe ekleyin. Tüpe sekiz mililitre sıcak kaplama ortamı ekleyin ve süspansiyonu dikkatlice karıştırın. Canlı hücreleri saymak için trypan mavi dışlama yöntemini ve hemositometreyi kullanın.
Sıcak kaplama ortamı ekleyerek, mililitre başına 50,000 hücre konsantrasyonu ayarlayın. Hücreleri iki yeni 384 kuyulu hücre kültür plakasına dağıtmak için, her kuyuya 25 mikrolitre ekleyin, bu da her kuyuda yaklaşık 12, 500 hücre verecek. 37 santigrat derece de nemlendirilmiş atmosferde 384-iyi plakalar içinde% 5 karbondioksit ile toplam üç ila dört hafta boyunca hücreleri kuluçka.
Ertesi gün, kaplama ortamını 50 mikrolitre sıcak bakım ortamıyla değiştirin. Daha sonra, her iki veya üç günde bir bakım ortamının yarısını değiştirin. Yedinci, 14 ve 21.
Hücreler kültürde üç ila dört hafta boyunca tutulduktan sonra, kendiliğinden spontan olarak spontan olarak küçülen sinif oluştururlar ve bileşiklerin bu kasılmalar üzerindeki etkisi ölçülebilir. Tarargünü, ilk hücre plakasının ölçüm için plaka okuyucunun içine yerleştirilmesinden en az iki saat önce, okuyucuyu açın ve ısıtma sistemini 37 santigrat dereceye ayarlayın. Bileşik plakaları hazırlamak için, oda sıcaklığına sıcak 40 bakım ortamı mililitre% 1 hacim-hacim penisilin streptomisin ile desteklenmiştir.
Orta ısınma iken, iyi başına stok çözeltisi 1,5 mikrolitre ekleyerek iki 384-iyi bileşik plakalar halinde test bileşikleri ve kontrolleri dağıtmak. Bileşik plakaları 100 G'de bir dakika lığına santrifüj edin. Her kuyuya 37 mikrolitre bakım ortamı ekleyin ve plakaları 100 G'de bir dakika daha santrifüj edin.
Floresan boya hazırlamak için, 37 derece santigrat su banyosunda% 1 hacim-hacim penisilin streptomisin ile desteklenen bakım ortamı sıcak 100 mililitre. Daha sonra, kalsiyuma duyarlı floresan boya ve quencher karışımı için bir stok floresan orta olarak yeniden oluşturmak için ısıtılmış orta 10 mililitre ekleyin. Plaka okuyucu yazılımını başlatın.
En az 10 hertz bir edinme sıklığı ile kalsiyum dalgaları iki dakikalık bir segment kaydetmek için yazılım hazırlayın. Floresan her hücre plakası için orta yapmak için, antibiyotikler ile sıcak bakım orta 12 mililitre stok floresan orta üç mililitre seyreltin. Hücre plakasının her kuyusunda 20 mikrolitre orta yı floresan orta ile değiştirin ve bir kez yukarı ve aşağı boru lar atarak karıştırın.
Bundan hemen sonra, HIPSCCM'lerin 60 dakika boyunca okuyucu sıcaklığına uyum sağlaması için plakayı bir plaka okuyucuya yerleştirin. Ardından, plaka okuyucu yazılımını başlatın. Her kuyu için temel dayak oranını tanımlamak için en az 10 hertz'lik bir kazanım frekansı ile iki dakikalık kalsiyum dalgaları segmentini kaydedin.
Veri edindikten sonra hücre plakasının aygıttan aktarılmadığından emin olmak önemlidir. Bazı yazılım sürümlerinde, kaydı tamamen sona ermeden önce durdurmanız gerekir. Test ve referans bileşikleri iyi-to-well bileşik plaka hücre plakası içine pipet için plaka okuyucu robot kullanın.
Bundan sonra, bileşik eklenmesinden sonra beş, 15, 30, 45 ve 60 dakika dan başlayan iki dakikalık kalsiyum dalgaları segmentlerini kaydetmek için plaka okuyucu yazılımında veri toplamabaşlatın. Veri analizini başlatmak için, ASCII metin dosyalarındaki plaka okuyucu yazılımından her kayıt dönemine ait ham verileri dışa aktarın. Ve sonra bunları veri analizi yazılımına aktarın.
Veri analizi yazılımından, her kayıt dönemi için birincil dayak sıklıklarını pano kopyaları olarak dışa aktarın. Her kuyu ve her zaman noktası için birincil dayak sıklığını ayıklayın. Son olarak, pano yapıştırma yoluyla bir elektronik tablo yazılımı içine dayak frekansları alma ve metin protokolü açıklandığı gibi veri analizi devam edin.
384 kuyulu bir plaka boyunca taban çizgisinde kalsiyum dalgalarının kaydedilmesi, çoğu durumda tüm kuyuların plaka boyunca çok az değişkenlik gösteren düzenli bir dayak oranını ortaya çıkardığını göstermektedir. Kardiyak iyon kanallarının blokerleri eklendiğinde kardiyomiyositlerin ritmini etkiler. Amlodipine, yavaş kalsiyum kanallarının bir engelleyici, bir mikromolar kadar konsantrasyonbağımlı bir şekilde fazla% 100 ritmi hızlandırır.
Ve bunun üzerine, amlodipine dayak tutuklar. Hızlı gecikmiş düzeltici potasyum kanallarının blokecisi olan E-4031, konsantrasyona bağlı bir şekilde 10 mikromolara kadar olan ritmi %65-70 oranında azaltır. Tetrodotoxin, hızlı sodyum kanallarının bir bloker kadar bir konsantrasyon bağımlı bir şekilde yaklaşık% 15 ritim yavaşlar 30 mikromolar üzerinde ise, tetrodotoksin ilk beş dakika içinde dayak tutuklar.
Kardiyak sodyum, kalsiyum ve potasyum kanallarının karışık bir blokeri olan bepridil, sodyum kanal bloğunun bepridilin birincil eylemi olduğunu düşündüren ya hep ya hiç etkisi üretir. Bu işlemi denerken, hücre kültürü plakasında pipetting son derece nazik olmayı unutmayın önemlidir. Bu dokular çok kırılgandır ve pipetlerle dokunulunca kolayca zarar görebilirler.
İnsan hücreleri ve aktif ilaçlarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken güvenlik eldiveni ve gözlük takmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.
