Verilerimiz, Rho-kiinaz aktivitesinin geçici inhibisyonunun, enfarktüs hayvan kalplerine nakledildikten sonra hiPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin yapışmasını, hayatta kalmasını ve engraftasyonunu artırdığını göstermektedir. Biz basit, düşük maliyetli sağlarken, yaralı hayvan kalplerinde nakledilen hiPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin engraftment artırmak için son derece verimli bir yöntem. Bu teknik akut kardiyak enfarktüs ve kalp yetmezliğinde hücre engraftment oranlarını güvenli ve verimli bir şekilde artırabildiğinden, kardiyak fonksiyon, vaskülar ve apoptozda ortaya çıkan iyileşmelere katkıda bulunur.
Protokollerimizi sadece hiPSC'lerde test etmemize rağmen, bu yöntemler embriyonik kök hücreler, mezenkimal kök hücreler ve saire gibi diğer hücre türlerine de uygulanabilir. Y-27632 tedavisinin dozu ve süresi önemlidir. Görsel gösteri, protokoldeki tüm önemli adımları ayrıntılı olarak gösterebilir, bu da bu tekniği daha önce hiç gerçekleştirmemiş biri için yararlıdır.
21. gün hiPSC-CM farklılaşmasından sonra, orta aspirasyon ve steril PBS ile hücreleri bir kez yıkayın. Hücreleri 0.5 mililitre hücre ayrıştırma enzimi ile 37 derecede 5-7 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka süresinden sonra, hücreleri iyice ayrıştırmak için bir mililitrelik pipet kullanarak hücre süspansiyonunu tekrar tekrar pipetleyin.
Sonra, her kuyuya bir mililitre nötralize çözeltisi ekleyin, hücre karışımını 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın ve üç dakika boyunca 200 kez g'de santrifüj yapın. Santrifüjden sonra, süpernatant atın ve nötralize çözeltisi hücreleri resuspend. Daha sonra, jelatin kaplı üzerine hücreleri yeniden bitki, iyi başına iki milyon hücre yoğunluğunda altı iyi plakalar.
24 ila 48 saat sonra, üç ila beş gün için arıtma ortamı ile kültür ortamı değiştirin. Transplantasyon dan önce, rb artı orta 12 saat boyunca tedavi grubundaki hücreleri kültür 10-mikromolar Y-27632 ile takviye. Benzer şekilde, 12 saat boyunca verapamil bir mikromol ile RB artı orta hücrelerde verapamil tedavi gerçekleştirin.
Tedaviden sonra hiPSC-CM'leri bir kez PBS ile yıkayın ve hücreleri her kuyubaşına 0,5 mikrolitre hücre ayrıştırma enzimi ile en fazla iki dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri iyice ayrıştırmak için bir mililitrelik pipet kullanarak hücre süspansiyonu tekrar tekrar pipetleyin. Daha sonra, nötralize çözeltisi ile hücreleri nötralize, 15 mililitrelik santrifüj tüp hücre karışımı toplamak ve üç dakika için 200 kez g santrifüj.
Santrifüjden sonra, enjeksiyona hazırlık olarak pbs'deki hücreleri beş mikrolitrede 0,1 milyon hücre konsantrasyonu yla yeniden askıya alın. Miyokard enfarktüsü indüksiyonundan hemen sonra, beş mikrolitre kontrol hiPSC-CM', Y-27632 önceden işlenmiş hiPSC-CM'ler, verapamil-tedavi hiPSC-CM'ler veya her sitede farenin miyokardiyumuna eşit miktarda PBS enjekte edin, her sitede bir tane enfarktüs alanında ve infarkt çevresindeki alanlarda iki. Kalsiyum geçici ve kontraktillik tespiti yapmadan 12 saat önce, hiPSC-CM'lerin kültür ortamına 10 mikromolar Y-27632, 100 nanomolar RA, tek mikromolar verapamil veya eşit miktarda PBS ekleyin.
Ardından, orta atın ve pbs ile bir kez plaka yıkayın. Ortamı, yüzey aktif polyol, beş mikromolar kalsiyum indikatörü ve buna karşılık gelen Y-27632, RA, verapamil veya eşit miktarda PBS'nin hacmini içeren bir fenol kırmızısız DMEM'e çevirin ve plakayı 30 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, süpernatant atın, boya içermeyen DMEM ile hücreleri üç kez yıkayın ve haritalama boyası de-esterify için 30 dakika orta dinlenme sağlar.
Hücre tohumu kapak kaymasını açık bir banyo odasına yerleştirin ve odayı otomatik sıcaklık kontrol ünitesiyle 37 dereceye kadar dengelenmiş bir mikro kuluçka sistemine yerleştirin. Tyrode'un çözeltisi ile perfuse ve perfüzyon çözeltisi için sürekli RI, RA veya PBS ekleyin. Bir x-t hattı taraması kullanarak spontan kalsiyum geçici kaydetmek için ters floresan mikroskop ve lazer tarama kafası kullanın.
Konfokal mikroskobun diferansiyel girişim kontrastı işlevini kullanarak hiPSC-CM'lerin spontan daralmasını kaydedin. Nakledilen hücrelerin sağkalım oranı artan luciferase aktivitesi ile doğrulandı. Artan insan kardiyak troponin T ve insan nükleer antijen ekspresyonu Y-27632 ön tedavi önemli ölçüde hücre engraftment oranını artırabilir gösterdi.
Y-27632 önceden işlem görmüş hücreler daha büyük ve daha tanımlı çubuk şeklinde sitoskeletyapısı sergiledi. Ayrıca, Y-27632 ön tedavi tunel-pozitif hücreleri azalttı, in vivo nakledilen hiPSC-CM apoptoz un azaldığını gösteren. Batı lı blot, Y-27632 ön işlem deingrin beta-1 ve N-kadherin ekspresyonunu artırdığını ve fosfo-miyozin ışık zinciri 2 ekspresyonunu azalttığını ileri sürmüştür.
Bu değişiklik Y-27632 çekilmesinden 72 saat sonra normale döndü. In vitro fare HL-1 hücre ek deneyleri Y-27632 ön işlem hl-1 göre hiPSC-CM bağlılık önemli ölçüde arttığını gösterdi. Y-27632 ön işlem kontraktil kuvveti, pik kalsiyum geçici floresan ve kalsiyum geçici süresini azalttı.
Y-27632 pretreatment düzenlenmiş kardiyomiyosit daralması önemli ölçüde cTnI ve cTnT ekspresyonu azaltarak. Y-27632'ye benzer şekilde verapamil ön işlem hcTnT/HNA çift pozitif hücrelerin luciferase aktivitesini ve sayılarını arttırmıştır. En önemli adım 10 mikromolar Y-27632 ile desteklenen Rb artı orta 12 saat boyunca tedavi grubunda kültür hücreleri için.
Bu yönteme dayanarak, y-27632 yavaş salınımı daha fazla hücre engraftment oranını artırmak için umut verici bir stratejidir. Bu teknik, araştırmacıların in vivo CMs hiPSC fizyolojisi ve fonksiyonu çalışma için önünü açıyor. Kardiyomiyosit farklılaşması için kullanılan küçük molekül CHIR99021 tehlikelidir, bu da solunum yolu tahrişine neden olabilir.
Lütfen herhangi bir şekilde solumayın ya da nefes almayın.
