Kalp hastalığı araştırma genellikle kemirgenler gibi küçük ve memelilerde yapılır. Ancak, insan kalbinin fizyolojisi Kemirgen kalbinin kinden önemli ölçüde farklıdır. Protokolümüz, Iskemik kalp hastalığını modellemek ve İskemik kardiyomiyositlerin hasar ını ve fonksiyonel bozukluğunu ölçmek için insan iPS hücrelerinden farklı kardiyomiyositler kullanmaktadır.
Bu protokol, bireysel hastalardan elde edilen iPS hücreleri kullanılarak kişiselleştirilmiş ilaç taraması için uygun bir yöntem sağlayabilir, taze ortam kullanımı gibi iPS hücrelerinin uygun kullanımı, ve orta yavaş ve zamanında değiştirilmesi fonksiyonel kardiyomiyositler içine başarılı bir farklılaşma sağlamak için önemlidir. Yun Liu, Yin Liang ve Mengxue Wang ile prosedürü gösteren Chen Wang, bir laboratuvardan doktora öğrencisi olacak. Kardiyak hücrelere Insan kaynaklı Pluripotent kök hücre farklılaşması ikna etmek için, ilk kat 96 iyi kültür plaka 100 mikrolitre ile 1.675 PBS laminin mililitre başına.
37 santigrat derecede 30 dakikalık bir kuluçkadan sonra, her kuyuya 10 mikromolar Y27632 ile takviye edilmiş 200 mikrolitre IPS bakım ortamında üç kez 10 ila dördüncü kök hücreyi görün ve plakayı Hücre Kültürü Kuluçka Makinesi'ne geri döndürün. 24 saat sonra, süper araçları kuyu başına 200 mikrolitre IPS büyüme ortamı ile değiştirin ve plakayı 2-3 gün daha Hücre Kültürü Kuluçka Makinesi'ne geri döndürün. Hücreler %70-80'e ulaştığında biraraya gelmek.
Her kuyudaki ortayı 200 mikrolitre önceden ısıtılmış farklılaşma ortamı A ile değiştirin ve plakayı 48 saat daha Hücre Kültürü Kuluçka Makinesi'ne geri döndürün. Kuluçka sonunda yavaş yavaş pre ısıtılmış diferansiyasyon orta B 200 mikrolitre ile her kuyuda supernatant yerini ve Hücre Kültür Kuluçka plaka dönmek. İki gün sonra, süpernatants pre ısıtılmış kardiyomiyosit bakım ortamı 200 mikrolitre ile değiştirin iyi başına ve 30 güne kadar Hücre Kültür Kuluçka için plaka döndü.
Kardiyomiyositlerin kontraktilliğini değerlendirmek için, parçacık görüntüsü velocimetry image j eklentisini takın ve faz kontrastmikroskobu ve çatal hedefini kullanarak hücrelerin video görüntülerini saniyede yaklaşık 20 kare saniyede yaklaşık 10 saniye boyunca kaydedin. Ardından video dosyasını API'mizi analiz ettiği gibi kaydedin ve belirtildiği gibi bir klasör yapısı oluşturun. Hücresel yer değiştirmenin ayrı iki boyutlu vektör alanlarını analiz etmek için VG'yi başlatın ve vektör çözümlemesi açmak için eklentileri, makroları ve düzenleyini seçin.
ijm, sonra analiz otomatik olarak yapılacak çalıştır'ı tıklatın. İskemik tedavi için, her kuyudaki süpernatantı glikoz ve serum olmadan 200 mikrolitre dmem ile değiştirin, sonra plakayı hipoksik bir odaya yerleştirin ve ardından azot gazını odaya aşılayarak iç oksijen konsantrasyonunu %2'de ve karbondioksit konsantrasyonu %5'te 24 saat boyunca muhafaza edin. Başarılı bir şekilde farklılaşmış hücreler, genellikle 20 günden kısa bir sürede spontan kasılma gösteren kültür kuyularının %50'si ile mikroskop altında gözlendiği gibi spontan kasılma gösterir.
Kardiyak marker protein de iskemik gruptan başarılı bir diferansiyasyon Hücreleri onaylamak için kullanılabilir genellikle MTT tahlillerde daha düşük bir canlılık sergilemek, ve normoksik kontrol grubundan daha düşük bir kontraktür. Propidium iyodür pozitif hücrelerin oranı da Iskemik grupta daha yüksektir, kontrol grubunda daha, hücresel hasar insidansı daha yüksek gösteren. Kardiyomiyositlerin kontraktilitlerinin karşılaştırılmasına izin vermek için yakalama plakasındaki ilgi bölgelerini doğru bir şekilde bulmanız önemlidir.
Bu teknik ilaç taraması için kullanılabilir, hasta kaynaklı iPS hücreleri kullanılarak. Ayrıca iskemik kalp hastalıklarının altında yatan mekanizmaları daha da açıklamak için benzersiz bir platform sağlar
