Ryanodine reseptör etki alanının yapısını çözmek, protein fonksiyonunun moleküler mekanizmasını, insektisit eylemini ve insektisit direnci gelişimini anlamamıza yardımcı olabilir. Bu ölçü, yakın atomik çözünürlükte protein yapısı tayini için altın standart olarak kabul edilen yapı illüstrasyonu için X-ışını kristalografisinin kullanılmasını ifade eder. Böcek ryanodin reseptör etki alanının bu yüksek çözünürlüklü yapısı kanal gating mekanizmasını ortaya koymaktadır ve yapı tabanlı ilaç tasarım yaklaşımları kullanarak türe özgü insektisitlerin gelişimi için önemli bir şablon sağlar.
Potansiyel protein kristalografları biyokimya, biyofizik, bilgisayar bilimleri ve matematik te yeterli olmalıdır, çünkü genellikle, bu yönteme yeni bireyler mücadele edecek. Polimeraz zincir reaksiyonu ile ilgi proteinine karşılık gelen DNA'yı yükselterek başlayın. Reaksiyonsonunda, reaksiyon karışımının tümünü %2 agarose jel üzerinde çalıştırın ve standart protokollere göre jel çıkarma kiti ile DNA ayıklayın.
Daha sonra, vektör DNA'sının 20 mikrolitresini 6 mikrolitre 10X reaksiyon tamponu ve 4 mikrolitre SspI restriksiyon enzimini 30 mikrolitre çift distile su ile karıştırarak LIC vektör DNA'sını doğrusallaştırın. Bu reaksiyon karışımını 37 derecede üç saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, üreticinin talimatlarına göre bir jel çıkarma kiti ile doğrusallaştırılmış vektör DNA çıkarma, bir % 1 agarose jel üzerinde tüm reaksiyon karışımı çalıştırın.
Daha sonra, standart protokollere göre doğrusallaştırılmış vektör DNA'sının 5 mikrolitresi ve PCR güçlendirilmiş insert DNA üzerinde ayrı T4 DNA polimeraz tedavileri yapın. Oda sıcaklığında 40 dakika kuluçka, ardından 75 santigrat derecede 20 dakikalık enzim ısı inaktivasyonu. Ligasyondan bağımsız klonlama reaksiyonunu, oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka için T4'ün 2 mikrolitresi ile t4 tedavi edilen insert DNA'sının 2 mikrolitresini birleştirerek gerçekleştirin.
BL21(DE3)E. Coli hücrelerini rekombinant plazmid ile dönüştürmek için, buz üzerindeki 50 mikrolitre yetkili hücreyi eritin ve tüpe yaklaşık 1 mikrolitre annelik plazmid ekleyin. Hücreleri ve DNA'yı karıştırmak için tüpü 2-3 kez hafifçe kaydırın ve tüpü 20 dakika boyunca tekrar buza yerleştirin.
Kuluçka sonunda, 42 santigrat derecedeki hücreleri 40 saniye boyunca ısı şoku, ardından iki dakika sonra buza geri döndü. Sonra, tüp oda sıcaklığında LB orta bir mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece 45 dakika boyunca 250 RPM shaker hücreleri yerleştirin. Sallayarak kuluçka sonunda, plaka 150-200 mikrolitre bu karışımın seçim plakaları üzerine, ve 37 santigrat derece bir gecede plakaları ters.
Ertesi gün, kültür 2-YT orta 100 mililitre tek bir koloni, kanamisin ile takviye, bir shaker inkübatör bir gecede 37 derece santigrat. Ertesi sabah, 2-YT orta bir litre inoculate, kanamisin ile takviye, gecede kültür 10 mililitre ile, ve OD600 okuma yaklaşık ulaşana kadar sallayarak 37 santigrat derece kuluçka. Daha sonra, IPTG ile kültürü 0.4 milimolar son konsantrasyona ikna ve 30 santigrat derece beş saat boyunca hücreleri büyümek.
Kuluçka sonunda, hücreleri santrifüj le hasat edin ve peleti 40 mililitre likis tampon konsantrasyonu başına 10 gram bakteriye yeniden askıya alın. Hücre duvarlarını %65 genlikte sonication ile bozun ve bir saniye kapalı bir saniye, sekiz dakika boyunca. Santrifüj ile hücre enkaz kaldırın.
Ardından, 22 mikrometrelik bir filtre olsa da süpernatant'ı filtreleyin ve çözümü bir örnek döngüye yükleyin. Füzyon proteinini arındırmak için, örnek döngüden filtrelenmiş süpernatantı 20 ila 250 milimolar imidazol lineer gradyan ile arıtma sistemi üzerinde beş mililitrenini-nitrolotriacetic kolona enjekte edin. Cleave tütün etch virüs proteaz ile eluted hedef protein, bir-to-50 oranı, bir gecede 4 santigrat derece, ve bir amylose reçine sütunüzerinde dekolte reaksiyon karışımı arındırın, ve bir nikel-nitroriacetic sütun, etiketi ve tütün etch virüs proteaz kaldırmak için.
Tuz konsantrasyonunu azaltmak için diyaliz tamponuna karşı nikel-nitrolotriacetic kolondan akan akışı diyalize verin ve elüsyon tamponunda 20 ila 500 milimolar potasyum klorür lineer bir degrade ile bir aniyon değişim sütunundaki numuneyi arındırın. Sonra, bir santrifüj konsantratörü protein konsantre. Homojenliği kontrol etmek için konsantre proteini Superdex 200 26/600 jel filtrasyon sütununa enjekte edin ve proteinin saflığını %15 SDS-PAGE ile değerlendirin.
Proteini kristalizasyona hazırlamak için, saflaştırılmış protein örneğini santrifüj konsantratöründe mililitre başına 10 miligrama konsantre edin ve 80 santigrat derece depolamadan önce tampon değişimini kristalizasyon tamponuna verin. Kristalizasyon taraması yapmak için, 295 Kelvin'de birkaç kristalizasyon kitleri ve 96 kuyulu formatta otomatik sıvı işleme sistemi ile oturma damlası buhardifüzyon yöntemini kullanın. Damla ayarının sonunda, buharlaşmayı önlemek ve rezervuar tamponu içindeki protein damlasının dengelemesini sağlamak için 96 kuyulu kristalizasyon plakasını kapatın.
Plakaları 18 derecede kristal bir kuluçka makinesine yerleştirin. Kristal oluşumunu ve büyümesini izlemek için plakaları ışık mikroskobu altında periyodik olarak kontrol edin. Tuz kristalleri protein kristalleri ayırt etmek için, hedef damla protein kristal boyabir mikrolitre ekleyin ve bir saat sonra mikroskop altında kristalleri gözlemlemek.
Protein kristalleri mavi görünür. Kristalleri daha da optimize etmek için, pozitif kristalizasyon koşullarını ve 24 kuyulu plakalarda asılı damla buhardifüzyon yöntemini kullanın, ardından 18 santigrat derecede kristal kuluçka makinesinde kuluçka yada. Protein yapısını belirlemek için, sıvı nitrojende flaş soğutma için bir ışık mikroskobu altında bir kriyoloop kristalleri monte ve depolama ve taşıma için bir unibuck kristalleri yerleştirin.
Kristalleri monte etmek ve merkeze almak için manuel merkezleme işlevini kullanarak, kristalleri şirket içi X-ışını difaktöründe ön ekrana getirin. Ardından, verileri toplamak için X-ışını kırınım yazılımını kullanın. HKL-2000 paketini kullanarak veri kümesini dizine koymak, tümleştirmek ve ölçeklendirmek için önce dedektörü seçin ve veri kümesini yükleyin.
Daha sonra, kırınım lekeleri bulmak için tepe arama işlevini yürütmek. Noktaları dizine dizine ekin, doğru boşluk grubunu seçin ve en yüksek tümleştirmeyi gerçekleştirin. Ardından, veri kümesini ölçeklendirin.
Hata modelini yeniden ayarlayın ve ölçeklendirin. Çıktı sca dosyasını kaydedin. Phenix yazılım paketini kullanarak yapıyı belirlemek için yeni bir proje oluşturun.
İlk olarak, asimetrik birimdeki protein moleküllerinin olası kopya sayısını hesaplamak için Extriage'ı sca dosyasıyla çalıştırın. Daha sonra, moleküler değiştirme ile faz problemini çözmek için Phaser'ı çalıştırın, kırınım veri dosyasını kullanarak Phaser'ı çalıştırın, hedef protein olarak yüksek sıralı kimlik ve yapısal benzerliğe sahip şablon yapı dosyası ve çözüm bulmak için protein dizisi dosyası. Phaser'dan gelen çıktı dosyasını ve hedef proteinden gelen sıra dosyasını kullanarak ilk modeli oluşturmak için Phenix'te otomatik yapı yı gerçekleştirin.
Yapıyı COOT kullanarak modifiye edilmiş deneysel elektron yoğunluğuna elle oluşturun ve yinelemeli döngülerde Phenix rafine kullanarak rafine edin. Phenix'teki doğrulama araçlarını kullanarak son modeli doğrulayın. Bu temsili deneyde, diamondback güve ryanodin reseptör proteininin son terminal etki alanının saflaştırılması, gösterildiği gibi, STS-PAGE analizi ile yaklaşık 21 kilodalton tek bir bant vermiştir.
Jel filtrasyon sütunundan gelen elüsyon hacmi saflaştırılmış ryanodin reseptör son terminal etki alanının monomer olduğunu doğruladı. Kristalizasyon için, yüksek kaliteli plaka şeklinde kristallerin oluştuğu en uygun koşullar pH 7'nin 1 azı HEPESi ve 1.6 molar amonyum sülfat varlığında ydı. Gösterildiği gibi yazılımları kullanan kırınım veri setinden protein yapısının belirlenmesi, 1'den 205'e kadar kalıntıları kapsayan diamondback güve ryanodin reseptör son terminal etki alanını ortaya çıkarmıştır.
Büyük bozukluğu, esnek bölgeleri veya zayıf yakınlıkları olan proteinlerkristalize etmek zordur. Bu senaryolarda, yüzey entropisi azaltma, döngü kesilme ve çapraz bağlama gibi protein mühendisliği stratejileri, daha iyi protein kristalleri elde etme olasılığını artırabilir. Yüksek çözünürlüklü protein yapılarını ortaya çıkarmanın yanı sıra, X-ışını kristalografisi de protein-pestisit etkileşimleri çalışmak için kullanılabilir, hangi yapı tabanlı pestisit tasarımı ile yardımcı olabilir.
