Protokolümüz bilim adamlarının hücre altı actomiyozin ağını tek tek epitel hücrelerinde analiz etmelerine yardımcı olur ve aynı zamanda kavisli epitel dokularda çok hücreli ölçekte benzer analizler yapmalarını sağlar. Protokolümüz Fiji uygulamasının güzel bir örneğidir. Sezgisel bir grafik kullanıcı arabirimine sahiptir ve komut dosyası bilgisi gerektirmez.
Bu nedenle, alanında acemi kullanıcılar için de son derece uygundur. Yöntemimiz Drosophila yumurta odaları için geliştirilmiş olmasına rağmen, Drosophila epitel dışında da uygulanabilir. Bilim adamlarını protokolümüzü model sistemlerinde test etmeye teşvik ediyoruz.
Bu protokole aşina olmak için eşlik eden test dosyalarını kullanın. Bu protokolün hangi bölümünün bireysel araştırma sorunuz için uygun olduğuna karar vermenize yardımcı olacaktır. Protokolün bu bölümü, kullanıcıların zaman atlamalı filmlerde epitel hücrelerini segmente etmesini ve surface manager'ı kullanarak zaman içinde hücrelerdeki actomiyozin darbelerini tek tek analiz etmesine olanak tanır.
Başlamak için Fiji'yi açın ve makro TissueCellSegmentMovie'yi alın. ijm olarak eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi. Ardından, ağartıcı düzeltilmiş bir TIFF dosyasını açın ve menü çubuğuna giderek, Görüntü'yü seçerek ve ardından Renk'i seçerek ve Split Kanalları seçerek ağartıcı düzeltilmiş dosyanın kanallarını bölün.
Yüklenen komut dosyasını, açık komut dosyasında Çalıştır simgesine basarak seçili hızlandırılmış filmin etkin hücre zarı kanalında çalıştırın. Güzel bir hücre maskesi almak için Gaussian bulanıklığını 2.500'e, hücre algılama hassasiyetini eksi bire ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, 63x hedefiyle edinilen hızlandırılmış filmler için tahmini gürültü toleransını 10 ile 20 arasında ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Oluşturulan hücre maskesi çözümlenen hızlandırılmış filmde görünür, ParticleStack adlı yeni bir pencere görüntülenir ve Eylem Gerekli adlı küçük bir pencere de görünür. Hızlandırılmış filmdeki hücre maskesinden yalnızca merkezdeki hücrelere odaklanın ve hızlandırılmış film boyunca tam ve iyi tanımlanmış anahatlar sağlayabilecek olanları seçin.
Merkezdeki seçili hücreler gerçek hücre zarlarına güzel bir şekilde karşılık geldiğinde, ParticleStack'i TIFF dosyası olarak kaydedin. Fiji'de ilgili ParticleStack TIFF dosyasını açın. Fiji'de Surface Manager eklentisi yüklüolduğu için eklentiyi açın.
Surface Manager'da, Anahat Oku görsel düğmesini tıklatın ve Jaccard dizini %60'a ayarlayın Anahatların yüklenmesi hücre sayısına bağlı olarak birkaç dakika sürebilir. Yüklendikten sonra, her hücreye bir S numarası atanır ve Surface Manager penceresinin sol bölümünde görünür. ParticleStack1'den alınan hücre anahattının seçili S numarasını tıklatın.
tiff hızlandırılmış filmde görünür. Film boyunca alınan her s numarasını hücre anahattı kalitesi için denetleyin ve yanlış hücre anahatlarını görüntüleyen istenmeyen hücreleri kaldırın. İstenmeyen bir hücreyi kaldırmak için hücre anahattını vurgulayın ve Sil düğmesini tıklatın.
Hücre anahatlarını düzeltmek için Fırça aracını kullanın. Tamamlandığında, düzeltilmiş hücreleri RoiSet olarak kaydedin. zip dosyası.
Analiz edilen dokuda actomiyozin darbelerinin bulunup bulunmadığını belirlemek ve akralozin sinyallerinin yönünün ayrıntılı davranışını anlamak için Fiji'yi açarak başlar. Hızlandırılmış bir film açın, kaydedilen ParticleStack1'i yükleyin. tiff hücre maskesi ve ağartıcı düzeltilmiş hızlandırılmış film, sonra Surface Manager eklentisi ve RoiSet ilgi ilgili bölge yükleyin.
zip dosyası. Ardından, Surface Manager'da ilgi sinyalleri içeren bir kanalı etkinleştirin. Dilime Göre Ortalama gri değeri Dilim adlı pencereyi elde etmek için İstatistikler düğmesini tıklatın.
Actomiyozin sinyallerinin ortalama ve ortanca yoğunlukları zaman içinde rasgele birimlerde ve hücrenin alanı ve şekliyle ilgili diğer parametrelerde görüntülenir. İstatistikler penceresine giderek, Dosya'ya tıklayarak ve As.Similar'u Kaydet'i seçerek, bir hücre maskesi oluşturarak ve doku ölçeğinde actomiyozin darbelerini analiz etmek için Surface Manager'a yükleyerek değerleri elektronik tablo dosyası olarak kaydedin. Protokolün bu bölümü kullanıcıların seçici zaman içinde kavisli epitel doku da aktomiyozin ince bir tabaka ayıklamak için izin verir.
Bu adımlar kullanıcı dostudur ve sezgisel bir grafik arabirimine dayanır. Fiji'yi açın ve Elipsoid Yüzey Projeksiyon eklentisinin takılı olduğundan emin olun. Ardından, hızlandırılmış bir film açın ve Eklentileri tıklatarak, BigDataViewer'a giderek ve XML/HDF5 dosyası olarak Geçerli Görüntüyü Dışa Aktar'ı seçerek XML/HDF5 dosyası olarak dışa aktarın.
Ardından, Eklentilere giderek, BigDataViewer'ı tıklatarak, ardından Elipsoid Yüzey Projeksiyonu'nu izleyerek ve XML dosyasını seçerek Elipsoid Yüzey Projeksiyonu'nda dışa aktarılan dosyayı açın. Bu, yumurta odasının sagital görünümleri ile yeni bir pencere açacak ve işleme yoluyla kullanıcıya rehberlik edecek bir iletişim görüntülenir. Yumurtalık Projeksiyonu adı verilen iletişim penceresinin birkaç sekmesi vardır.
Sınırlama kutusu olarak adlandırılan ilk iletişim sekmesinde, zaman atlamalı filmdeki bir yumurta odasının x ve y kenarlıklarını sınırlayıcı kutunun z genişliğiyle birlikte tanımlayın ve sete basın. Yumurta odasının seçilen kısımları pembe renkte vurgulanır. Ardından, Yumurtalıkprojeksiyon penceresinde ki blobları bul adlı iletişim sekmesinde sinyal lekelerinin boyutunu tanımlayın.
Sigma ve en az tepe değerini tanımlayın. Daha sonra, yeşil lekeler olarak görünecek actomiyozin sinyalleri tanımlamak için hesaplama ya basın. Yaklaşık 100 nokta bulunana kadar farklı parametrelerle bu adımı yeniden deneyin.
Actomiyozin sinyallerini tanımlamak çok önemli bir adımdır. Sinyal kalitesine ve algılanan lekelerin doğru boyutuna bağlıdır. Görüntüde görünür yeşil noktalar yoksa, bir sonraki adım çalışmaz.
Elipsoidi tasarlamak için fit elipsoid adı verilen sekmeyle devam edin. Rasgele örnekleri 10,000'e, dış/iç kesme mesafesini 1'den 10'a ayarlayın ve ardından hesaplamayı tıklatın. Bundan sonra, projeksiyon adı verilen sekme otomatik olarak açılır ve yüzey ekstraksiyonunun tanımına izin verir.
Projeksiyon sekmesinde, istenilen elipsoid genişliği olarak minimum ve maksimum projeksiyon mesafesi ayarlayın. Pembe tanımlı elipsoid bölge yumurta odasının tüm dış tabakasını içermelidir böylece minimal ve maksimal projeksiyon mesafesi uygun olmalıdır. Ardından, dilim uzaklığı bir olarak tanımlayın.
Hesaplamaya basmadan önce elipsoidin pembe bölgesinin yumurta odası üzerinde tanımlanan pembe bölgesinin görünür olduğundan emin olun. Bu yeni bir elipsoid uyum kalitesini değerlendirmek için yardımcı olur. Ardından, elipsoidin çıkış genişliğini 800'den büyük veya eşit ve 400'den büyük veya eşit bir yüksekliğe ayarlayın.
Daha sonra, yüzey çıkarma süresini ayarlayın ve küresel veya silindirik bir projeksiyon seçin. Gerekirse, görüntü adı verilen yeni pencerelerdeki her iki kanal için de yüzey ekstraksiyonu elde etmek için Z tuşuna basın ve Y.Press bilgisayarlarını hizala. Görüntü'ye tıklayarak, Ayarla'ya giderek ve Parlaklık/Kontrast'ı seçerek yansıtılan actomiyozin sinyallerini görebilmek için elde edilen görüntü pencerelerinin parlaklığını ve kontrastını ayarlayın.
Yüzey ekstraksiyonu iyi görünüyorsa, her iki kanalı da TIFF dosyaları olarak ayrı ayrı kaydedin. Ayrıca, bu yumurta odasının yüzeyinin nasıl çıkarıldığına yönelik ileride başvuru için Log penceresi dosyasını kaydedin. Ardından, kanalları Fiji'de tercih edilen bir renk koduyla birleştirin ve sonuçları TIFF dosyaları olarak kaydedin.
Bu protokol bilim adamlarının epitel dokularda actomiyozin ağlarının davranışını araştırmalarını sağlar. Bu ancak yerel hücresel ölçekte aktomiyozin davranışının ayrıntılı bir analizi doku ölçeğinde benzer bir analiz ile kombine edildiğinde mümkündür. Burada gösterilen yerel hücresel ölçekte dinamik miyozin II davranışıtemsili örnekler ve kontrol ve fat2 mutant Drosophila yumurta odaları için doku ölçeğinde.
Bazal tek düzlemde, miyozin II sinyallerinin yeşil modifiye düzenleyici ışık zinciri kontrol yumurta odalarının ön-posterior eksenine dik hareket. Bu polarite fat2 mutant yumurta odalarında kaybolur ve anisotropik miyozin II darbeleryol açar, doku düzeyinde salınımlar, kontrol örneğinde miyozin II yeşil modifiye düzenleyici ışık zinciri epitel rotasyonu teşvik etmek için gerekli senkronize kuvvet oluşturur. Buna karşılık, bazal tarafında güçlü bir yağ2 mutant yumurta odası nabız folikül epitel ve epitel rotasyon teşvik etmek için gerekli senkronize kuvvet oluşturmak için başarısız olur.
Drosophila yumurta odası ince bir apikal bölgede, fat2 mutant da miyozin II yeşil modifiye düzenleyici ışık zincirinin değiştirilmiş dinamik davranış ile sunar.Bu videoyu izledikten sonra, Fiji kullanarak Drosophila yumurta odalarında yerel ve doku ölçeğinde bir actomiyozin ağ analiz etmek için nasıl iyi bir fikir olmalıdır. Daha fazla pratik ipucu ve sorun giderme için lütfen protokolden sonraki tartışma bölümüne bakın. Fiji veya eklentilerimizle ilgili sorularınız varsa, ilgili web sayfalarına bakın veya bizimle iletişime geçin.
