Bu yöntem, Drosophila embriyomeydana kas kasılmaları ve haddeleme gibi gelişimsel süreçlerin nasıl analiz edilebildiğini ele almaktadır. Bu tekniğin bazı avantajları noninvaziv ve oldukça ayrıntılı olması, henüz nispeten gerçekleştirmek için basittir. Yöntemimiz, embriyonik kas kasılmaları ve diğer gelişimsüreçlerini etkileyen yeni mutasyonları izole etmek ve analiz etmek için yüksek içerikli analiz tabanlı tarama için daha da geliştirilebilir.
Kas kasılmaları görselleştirme, kasılmalar sadece belirli bir gelişimaşamasında başlar, çünkü düzgün zaman embriyo koleksiyonları için önemlidir. Adım adım görsel gösteri, gelişim süreçlerinin nicel analizine büyük ölçüde yardımcı olabilir. Monte Drosophila embriyolarının canlı görüntülemesi için, embriyoları timelapse fonksiyonu ve uygun emisyon filtrelerine sahip bir dijital kamera ile epifloresans mikroskobunun sahnesine yerleştirin ve 10X su daldırma objektif lens seçin.
Daha sonra canlı video saniyede dört kare bir satın alma oranı ile yaklaşık bir ila iki saat için uygun mikroskop kayıt yazılımı kullanarak embriyolar kaydedin. Denemenin sonunda, kaydedilen videoyu doğrudan ImageJ'ye aktarın. Her embriyonun etrafına bir kutu çizmek için görüntü ve kırpma seçin ve video kayıtlarını her embriyonun boyutuna göre kırpın.
Kırpılan görüntüleri döndürmek ve ekrana göre embriyo orta hattının dikey konumunu elde etmek için Görüntü, Dönüştür ve Döndür'ü tıklatın. Mesafe ölçümlerini mikrometrelere ayarlamak için, Çözümle ve Ölçeği Ayarla'yı tıklatın ve ardından mikroskop kurulumunuz için bilinen pikselden mikron oranına dönüşüm faktörü girin. Daha sonra yapılan tüm ölçümler mikrometreler halinde raporlanacaktır.
Embriyo yuvarlanmasını analiz etmek için, ilk olarak bir embriyonun bir veya her iki trakeasının konumunu arka ve ön uçlar arasındaki videonun ilk karesinde işaretleyin ve Analyze, Tools and Region of Interest Manager'ı tıklatın. Trakeanın etrafına yaklaşık yedi mikrometrelik bir kutu çizin ve bu konumu XY koordinatı olarak kaydetmek için klavyedeki T tuşuna tıklayın. İlgiperistaltik daralmalardan sonra trakeanın aynı alanının konumunu işaretleyin ve daralma öncesi konumdan daralma sonrası pozisyona olan mesafeyi ölçmek için klavyedeki M tuşuna basan her kutunun merkezlerini birbirine bağlayan bir çizgi çizin.
Floresan kas belirteçleri ifade embriyolar kullanarak embriyonik kas kasılmaları analiz etmek için, ilgi belirli bir vücut segmentinin floresan kasları etrafında merkezli bir ilgi bölgesi çizmek için floresan okuma kaydını kullanın. İlgi alanı yöneticisinin konumunu kaydetmek için İlgi Alanı Yöneticisi'nde T Ekle sekmesini seçin. Videonun her karesi için seçilen ilgi alanının her bölgesinin ortalama floresan yoğunluğunu kaydetmek için İlgi Alanı Yöneticisi ve Ölçü'yi tıklatın.
Kutuyu ilgi çekici diğer gövde segmentlerinin merkezlerine taşıyın ve analiz edilecek tüm gövde segmentlerinde aynı boyutta ilgi alanları elde etmek için konumlarını kaydetmek için T Ekle'yi tıklatın. İlgi Alanı Yöneticisi'nde, XY koordinatları olarak kaydedilen tüm ilgi alanları seçerken Denetim anahtarını tutun. Videonun tüm kareleri için ilgi çekici her bölgenin ortalama floresan yoğunluğunu ölçmek için Daha Fazla ve Çoklu Ölçü'yi tıklatın.
Bu, her ölçümü tablonun sütunu ve her karenin satır olarak ilgi alanı olan bir tabloda raporedecektir. Daha sonra daha fazla analiz için tabloyu elektronik tablo programına aktarın. X ekseninde kare numarası ve y eksenindeki ortalama floresan yoğunluğu içeren bir grafik çizin ve kare numarasını saniye kare hızı başına dört kare yi kullanarak zamana dönüştürün.
Kas kasılmaları gfp yoğunluğunu artırır, çünkü bu kasılmalar sırasında daha fazla kas çekildikçe odak bölgesinin çevresine daha fazla GFP getirir. Kas kasılması genliğini belirlemek için, zirveler arasındaki bölgelerin ortalama yoğunluğu olarak temel GFP yoğunluğunu tahmin edin. Daha sonra bu taban çizgisine göre GFP floresan yoğunluğundaki artışı değerlendirin.
Ardından, GFP yoğunluğunu taban çizgisine normalleştirmek için ilgi yoğunluğu değerinin her bölgesini taban çizgisine bölün. Dalga yayılırgibi kas kasılma ölçüde değişiklikleri incelemek ve dalga yönünü belirlemek için kas kasılma dalgası sırasında posterior, medial ve ön segmentlerde normalleştirilmiş GFP yoğunlukları karşılaştırın. Embriyonun sol ve sağ tarafındaki kas kasılmaları karşılaştırmak için, embriyonun her iki tarafında ki aynı segmentler için tepe yoğunluklarını analiz edin.
Eğer varsa, farklılıkları ve peristaltik kas kasılması dalgalarının kapsamını ve zamanlamasını ortaya çıkarmak için kasılma genliğini ve zirvelerin zamanlamasını kullanın. Burada yabani tip Drosophila embriyosunda normal peristaltik kas kasılmaları gösterilmiştir. Yabani tip bir embriyo haddeleme bu videoda, dorsal uzantının hareket etmediğini, trakea ise embriyonun kabuğunun içinde yuvarlandığını gösterir.
Bu temsili analizde, kas kasılması 165-178 saniyelik zaman diliminde zirveler tek bir ileri dalga temsil eder. Bu embriyo için embriyonun sağ ve sol taraflarında kas kasılmaları ve genlik lerinde bir fark yoktur. Peristaltik daralma, profili ilk olarak orta ve ön bölgelerdeki zirveler takip eden arka bölgede ortaya çıkan bir tepeye sahipse, ileri tip bir dalga olarak belirlenir.
Geriye doğru tip bir dalga, önce ön segmentlerde ortaya çıkan ve daha sonra arka bölgelere doğru yayılan bir tepedir. Tip iki dalgalar embriyonun bir ucundan başlar ve karşı uçta yeniden başlatılan süpürme dalgası olarak kökenlerine dönmeden önce orta bölgelere doğru ilerler. Vücut duruşu mutant embriyolar tip bir tip bir anormal göreceli frekans göstermek iki dalga nesil vücut burulma veya rotasyon fenotip olarak belirlenen bir vücut duruş anormalliği ile sonuçlanır.
Kas kasılması parametreleri için bir okuma olarak floresan kullanmak için, kas dokusunda bir muhabir ile embriyolar kullanmak esastır. Bu yöntem birçok embriyokas kasılmaları eşzamanlı kayıt ve çeşitli uyaranlara tepkilerin değerlendirilmesi için kullanılabilir, ilaçlar veya çevresel değişiklikler.
