Bisülfit dönüşüm protokolü Genomik DNA 2 mikrogram dönüşüm için standart bir protokol aşağıda açıklanmıştır. Genomik DNA (100 pg-200 mg) daha küçük veya büyük miktarda, aynı zamanda başarılı bir şekilde tedavi bisülfit olabilir. Bu tepkime koşulları hemen hemen her hedef DNA dizisi 3 tam dönüşüm (% 99,5-99,7) sonuçlanır. 1. DNA hazırlığı 37 ° C Not 1 saat için 18 ul toplam hacim bisülfit DNA Lizis Buffer (2 mg t RNA 280 ng / ul Proteinaz K,% 1 SDS) ile genomik DNA kuluçka örnekleri hazırlayın: Bunu başarmak için önemlidir. özellikle hala DNA ile ilişkili protein olabilir klinik örneklerden izole edilen DNA ile maksimal bisülfit dönüşüm . 2. DNA denatürasyonu <ol><li> Son c taze hazırlanmış 3M NaOH 2 ul ekleyerek 20 ul bir ses doğasını 2 mg DNA0.3M, oncentration. </li><li> 37 ° örnekleri inkübe ° C su banyosunda 15 dakika süreyle bir ısı bloğu içinde 2 dakika süreyle 90 ° C&#39;de inkübasyon izledi. Hemen 5 dakika boyunca buz üzerinde tüplerin yerleştirin. </li><li> 4 ° C, 10 s 10.000 g sağlamak için DNA tüpün dibinde tüplerin santrifüjleyin. </li></ol> 3. Bisülfit Deaminasyon Sülfonasyon &amp; Hidrolitik Deaminasyon <ol><li> 10 mM Quinol ve doymuş sodyum metabisülfit pH 5.0 (464 ul 10 M NaOH ile 7.6 g Na 2 S 2 O 5, 15 ml su ile yapılmış) taze çözümler hazırlayın. Doymuş sodyum bisülfit çözüm asgari karıştırma ve havalandırma ile, yavaşça tersine reaktif / H 2 O karışımı ile elde edilir. Gerekirse, metabisülfit Not tam olarak kapatılması için 10 M NaOH ile pH ayarı: doymuş bir çözüm olduğu için, küçük topaklar hala çözünmeden kalır . </li><li> 208 ekle2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5.0 nihai konsantrasyonu 240 ul nihai hacmi doymuş metabisülfit ve denatüre DNA (20 ul) 10mM Quinol 12 ul ul. Damlacıkları tüpün alt kısmında sağlamak için 10 sn için tüm reaktifler ve santrifüj yavaşça karıştırın. </li><li> 200 ul madeni yağ numuneleri Overlay. Numuneler 55 ° C su banyosu, 4-16 saat inkübe edin. Bisülfit tedavi süresini dönüştürülecek DNA miktarı ve kalitesi bağlıdır. Kalitesiz ya da bozulmuş DNA DNA, 4 saat inkübasyon süresi sınırı Not: inkübasyondan önce folyo tüpler mümkün şal değildir eğer öyleyse, bu bisülfit dönüşüm oksidasyon önlemek için karanlık yer aldığı önemlidir. . </li><li> Uygun inkübasyon süresi sonunda, tüm sıvı tüpün dibinde olduğundan emin olmak için bir mikrosantrifüj kısaca tüpler döndürmek. </li><li> Bisülfit tedavi DNA Kurtardikkatle herhangi bir mineral yağ almadan, tüpün dibinden DNA çözüm pipetleme yağ tabakasının altında. </li></ol> Tuzsuzlaştırma <ol start="5"><li> Tuzsuzlaştırma sütun geçerek, 50 mili-Q suyu (MQH 2 O) ul salınımlı herhangi bir ücretsiz bisülfit iyonlarının çıkarın . Genomik DNA&#39;nın miktarı ve kalitesi üzerinde ve nasıl hazırlanır bağlı olarak, farklı tuzsuzlaştırma sütun kullanılabilir. Biz rutin olarak bu sütunların SDS dönüşüm için önce DNA hazırlanmasında kullanılan kaldırmak için uygun Promega Sihirbazı, sütunlar temizleyin kullanın. </li></ol> Alkali Desulphonation <ol start="6"><li> Bisülfit adduct desulphonation urasil halka çıkarılır. Desulphonate 0.3M bir son konsantrasyonu 5.5 ul taze hazırlanmış 3M NaOH ekleyerek, örnekleri daha sonra 37 ° C&#39;de 15 dakika süreyle kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Kısaca Santrifüj ve t RNA (10 mg / ml) 1 ul ekleyin. </li> &lt;li&gt; amonyum asetat 33 ul (NH 4 O Ac), 3M nihai konsantrasyonu pH 7.0 ilavesi ile çözüm nötralize. </li><li> Buz gibi% 100 etanol 330 ul ekleyerek Etanol çökelti DNA tersine çevirerek iyice karıştırın. -20μC gecede 1 saat bırakın. 15 dakika 14.000 g Santrifüj 4 ° C Süpernatant ve hava tüm izlerini ~ 20 min çöktürülmüş DNA kuru çıkarın. </li><li> 0.1 TE (10mM Tris-HCL, 0.1mm EDTA, pH 8.0) veya H 2 O 50 ul / mg DNA pelet yeniden askıya Yaklaşık 2 saat oda sıcaklığında bekletin. DNA sağlamak Bazen vorteks tüpleri, ardından hızlı bir santrifüj, çözünmüş. </li><li> DNA miktar ve kalitesine bağlı olarak 1-10 yıl boyunca -20 ° C&#39;de PCR veya mağaza için hemen kullanın. </li></ol> 4. PCR Amplifikasyon Primer Tasarım <ol><li> PCR bisülfit dönüşüm spesifik primerler Etkin tasarım crucial DNA&#39;nın tamamen dönüştürülen bu verimli, tarafsız amplifikasyon sağlamak için oluşur. Aşağıdaki yönergeler, astar tasarım yardım için kullanılacak. </li></ol> Primer Tasarım Kuralları <img src="files/ftp_upload/3170/3170list1.jpg" /> Thermocyling <ol start="2"><li> Orantılı metillenmiş ve unmethylated DNA PCR testi için, bir metil 50:50 / Unmethylated tam bisülfit dönüştürülür kontrol örneği kullanın ve optimize edilmiş PCR reaksiyon koşulları (Şekil 3) altında bisülfit dönüşüm spesifik primerler ile amplifiye. 50:50 metil: Unmethylated kontrolü, in vitro SssI metillenmiş DNA ve ya tüm genom (WGA) amplifiye DNA veya tam kan DNA kullanın. Bazı genlerin doğal kan metil ve bu nedenle bu gibi durumlarda sadece &quot;Unmethylated&quot; kontrol WGA DNA kullanmak en iyisi olacaktır ki farkında olun. </li><li> 100 &amp; m PCR reaksiyon karışımları hazırlayınu; l 2 ul dönüştürülür bisülfit genomik DNA, 200 mcM dNTP, 1 mcM primerler, 1.5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10mM Tris-HCL, pH 8.3 ve 0.15 ul Taq polimeraz içeren alikotları. </li><li> 3 ° C üzerinden astar tahmin Tm 10 tüp, bir sıcaklık degrade PCR degrade çalıştırmak reaksiyon + / </li></ol><img alt="Tablo 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170table1.jpg" /><ol start="5"><li> Metillenmiş ve unmethylated amplikonlarının orantılı olarak amplifiye olduğunu test etmek için, Amplikon metillenmiş DNA sindirimi Taq 1 (TCGA) gibi bilgilendirici bir restriksiyon enzimi, sindirilmiş, ancak kısıtlama enzim sitesi unmethylated DNA sindirimi olmaz TTGA için bisülfit dönüşüm sonra değiştirdi. Sindirim ölçüde agaroz jel elektroforezi (Şekil 3A) tarafından görüntülenmiştir. Alternatif olarak, PCR reaksiyonu SYBRGreen (0.2 1:1000 dilüsyon ul) eklenir ve olabilirmetilasyon ölçüde bir real-time PCR PCR (Şekil 3B) ısı disosiasyon araziler yaparak değerlendirilebilir. </li><li> MgCl 2 konsantrasyonu ve thermocycling koşulları da dahil olmak üzere PCR Reaksiyon karışımı PCR verimliliğini artırmak veya metil ve unmethylated PCR parçaları orantılı PCR sağlamak için ayarlanması gerekebilir. </li><li> PCR koşulları optimize sonra, PCR bisülfit dönüştürülen numuneler üzerinde yapılacaktır Not: Bir kez Tm sıcaklık degrade PCR kullanılabilir gerekmez optimize edilmiştir . </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Bisülfit PCR optimizasyonu bir örnek Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. Optimal PCR amplifikasyon koşulları oran ve önyargısız, metil ve unmethylated amplikonlarının yükseltilmesi gerekir. Şekil 3A% 50 metil ve unmethylated DNA karışımı bir sıcaklık gradyanı PCR profili ile bir agaroz jel gösterir. The PCR amplikonlarının metillenmiş sindirimi bir kısıtlama enzim, Taq 1 (TCGA), (M) DNA ile tedavi edilmiştir ancak TTGA için bisülfit dönüşüm restriksiyon enzimi sitesi tarafından değiştirilmiş olarak (U) DNA unmethylated sindiremez. Kesilmiş ve kesilmemiş PCR ürünü eşit miktarda metil ve unmethylated DNA orantılı olarak yükseltilir bekleniyor. -Önyargı olmayan amplifikasyonu için optimal thermocyling koşulları 56.1 olduğunu, bu jel üzerinde görülebileceği ° C (T). Bisülfit DNA komple dönüşüm sitozin-sitesi hpa III (CCGG) gibi spesifik bir enzim ile sindirime de analiz edilebilir. Dönüştürme başarısız oldu hpa III sadece kısıtlama sitesi muhafaza edilecektir sindirir. Dönüştürme işlemi tamamlandığında ise kısıtlama site TCGG veya DNA metilasyon durumu bağlı TTGG dönüştürülmüş olacak. Komple bisülfit DNA dönüşüm Şekil 3A (H) görülebilir. Şekil 3B gerçek zamanlı bir ayrılma arsa gösterirfarklı moleküller ayrıştırmaları hangi sıcaklık dayalı herhangi bir amplifikasyon önyargı var olup olmadığını belirlemek için bir araç olarak da kullanılabilir. Bu şekilde PCR 82.1μC az ayrıştırmaları tamamen metillenmiş ve unmethylated DNA amplifikasyon kontrol ile karşılaştırıldığında,% 50 metillenmiş ve unmethylated DNA karışımı oranında metil amplifiye (M) ve (U) unmethylated DNA olduğunu görülebileceği sırasıyla 78.9μC. Thermocyling ve reaksiyon koşullarının optimizasyonu sonra bisülfit tedavi örnekleri tek bir ya da yarı nested PCR reaksiyon ya iplikçik bisülfit özel ve spesifik primerler ile amplifiye edilebilir. Çıkan PCR parçaları agaroz jel elektroforezi ile görüntülenir (Şekil 4A) ya doğrudan ya da klonlama ve sıralama sıralı olabilir. Klonlama ve bireysel moleküllerinin metilasyon devlet sıralama heterojen görselleştirmek için bisülfit bir harita (Şekil 4B), cetvel sonrametilasyon. Yüksek verim kantitatif metilasyon analizi gibi Sequenom EpiTYPER yöntemi tarafından kullanılan teknoloji kullanılarak preformed olabilir. Bu yöntemi kullanarak, bisülfit dönüştürülür DNA bisülfit spesifik PCR primerleri ile amplifiye ve bir proprietry bölünme süreci izledi. Çıkan parçaları metil cytosines (Şekil 5A) varlığına bağlı özel spektrum MALDI-TOF kütle spektrometresi tarafından quantitated. Metilasyon oranları örnek bir özetini sonra bir özdeyişinin (Şekil 5B) veya metilasyon arsa (Şekil 5C) şeklinde çıkarım olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig1.jpg" /> Şekil 1. (Gri) gen bedenlerinizde CpG siteleri seyrek ve genellikle metil (kırmızı) ise normal hücre, organizatörü ile ilişkili CpG adalar ağırlıklı metil CpG şematik. Unmethylated. Sağdaki panel, moleküler yapısı genişletirbireysel bir CpG yerinde DNA ure ve sitozin 5 karbon CH3 molekülü ile metilasyon gösterir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig2.jpg" /> Şekil 2. Denatürasyon, bisülfit dönüşüm, PCR ve analizi; Kimyasal dönüşüm şematik analizi, DNA metilasyon gösterildiği gibi dört ana aşama içerir . Sağ panelde, sitozin molekülünün bisülfit dönüşüm sırasında meydana gelen değişiklikler tasvir edilmektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig3.jpg" /> Şekil 3. PCR A. Optimizasyonu % 50 metil ve unmethylated DNA karışımı bir sıcaklık gradyanı PCR profili agaroz jel elektroforez. Fragments sırasıyla metillenmiş DNA ve olmayan bisülfit dönüştürülür DNA sindirimi Taq1 (T) veya HpaIII (H) ya da sindirilmiş edilmiştir. B. Isı dissosiyasyon eğrisi analizi denklemleri gösterirmetillenmiş ve unmethylated DNA (kırmızı çizgi 50/50 mix) l oranı kontrolü tamamen metillenmiş amplifikasyon (pembe çizgi, M) ve ° C ve 78.9 ° C sırasıyla 82.1 ayrıştırmaları unmethylated DNA (yeşil hat, U). <img alt="Şekil 4a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4a.jpg" /> <img alt="Şekil 4b" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig4b.jpg" /> Şekil 4. Doğrudan sıralama örneği ve bisülfit haritası A. Sıra iz sarı vurgulanır CpG siteleri ile üç farklı hücre hatları. Hücre hattı X hücre hatları Y ve Z G / A sinyaller üst üste görüldüğü gibi metilasyon değişik derecelerde ise her üç CpG siteleri% 100 metilasyon gösterir. B., bireysel klonların doğrudan sıralama belirlenir, bireysel CpG siteleri metilasyon (kırmızı noktalar) yoğunluğu gösteren Temsilcisi bisülfit harita. <img alt="Şekil 5a" src="/files/ftp_upload/3170/3170fig5a.jpg" /> Şekil 5. Sequenom A. kullanarak yüksek verim DNA metilasyon analizi Sequenom epiTYPER teknolojisini kullanarak Spektrum görünümü. DNA parçalarının DNA metilasyon mevcut miktarına bağlı olarak, belirli spektrumları gösterir. B. DNA metilasyon yüzde CpG dört farklı hücre hatları için her yerinde özdeyişinin özeti. C. Metilasyon arsa özeti Sequenom özdeyişinin türetilmiştir.

<ol>
	<li>Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands.">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 1827-1831 (1992).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines.">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic. Acids. Res. 22, 2990-2997 (1994).</li><li>Grunau, C., Clark, S. J., Rosenthal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisulfite+genomic+sequencing:+systematic+investigation+of+critical+experimental+parameters.">Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters.</a> Nucleic. Acids. Res. 29, E65-E65 (2001).</li><li>Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+bisulphite+modification+and+analysis.">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> Nat. Protoc. 1, 2353-2364 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

DNA metilasyon analizi bisülfit dönüştürülen DNA genom dizileri tek nükleotid çözünürlükte DNA metilasyon belirlenmesi ve miktar kolaylaştıran bir köklü ve çok yönlü bir yöntemdir. Ancak, bisülfit dönüşüm ve sonraki analiz DNA tam her unmethylated sitozin urasil deaminated ve sadece metil cytosines un-reaktif kalan dönüştürülmüş olduğunu önermesine dayanır. Dönüştürülmemiş unmethylated cytosines dönüşüm eksik ise yanlış metil cytosines olarak yorumlanabilir bu yana, sorunların analizi ile ortaya çıkabilir. Bisülfit dönüşüm dönüşüm oranını en üst düzeye çıkarmak için çeşitli aşamalarında optimize edilebilir. DNA tam olarak dönüştürülebilir için sitozin kalıntılarının bisülfit iyonlarının maruz böylece ilk telli tek olmalıdır. Ilk adım, DNA denatürasyon, kritik ve DNA tam denatüre değilse eksik dönüşüm kaynağı olabilir. Sağlamak içinDNA tam denatüre olduğunu, ilgili tüm protein kaldırılması, uygun tuz konsantrasyonu, inkübasyon sıcaklığı ve saati de dahil olmak üzere reaksiyon parametreleri, tek sarmallı konformasyon DNA korumak için uygun olması önemlidir. Taze 3M NaOH kullanmak ve uygun inkübasyon süresi izin için önemlidir. DNA denatürasyon direnen ise, inkübasyon süresi 30 dakikaya kadar uzanan veya denatürasyon için önce DNA parçalanan protokol de dahil olmak üzere bazı değişiklikler DNA&#39;nın denatürasyon kolaylaştırabilir. Buna ek olarak, tek sarmallı DNA (ssDNA) bisülfit dönüşüm reaksiyon sırasında çift sarmallı DNA (dsDNA) yeniden tavlama olabilir. Ya periyodik veya sürekli bisülfit reaksiyon sırasında daha yüksek bir sıcaklık (90-95 ° C) reaksiyonu Taşıma ssDNA bakım yardımcı olabilir. Ancak, DNA&#39;nın bozulması, bu yüksek sıcaklıklarda büyük ölçüde hızlandırılmış olduğunu farkında olmak önemlidir. Çeşitli reaktifler th yeniden tavlama bozabilir eklenebilire DNA ipliklerini, üre gibi. DNA ve kalitesini konsantrasyonu da bisülfit reaksiyon verimliliğini ve nihai PCR verimi etkileyebilir. DNA&#39;nın bozulması, bisülfit dönüşüm protokolü bir sınırlama yoktur. DNA&#39;nın kimyasal arıtma çeşitli iplikçik ssDNA sonları ve bazı yüksek bisülfit konsantrasyonu, uzun kuluçka süreleri DNA düşüşü hızlandırabilir de dahil olmak üzere tam bisülfit dönüşüm için gerekli olan sert koşullar tanıtır. Açıklanan standart reaksiyon şartları altında, protokol değişiklikler tanıtıldı, DNA&#39;nın bozulması, bozulmuş ya da FFPE örnekleri gibi kalitesiz DNA şablonları için, bu tür dönüşüm dirençli dizileri için, ancak DNA bozulması ortak bir sorun değildir önemli bir sınırlama olabilir. Formalin sabit, parafin (FFPE) ve bozulmuş DNA örnekleri, bu protokolü etkin kullanılarak dönüştürülür ve amplifiye bisülfit olabilirAncak DNA daha da bozulmuş olmadığından emin olun değişiklikler tavsiye edilir. T RNA gibi bir taşıyıcı RNA kullanılması tavsiye edilir. DNA konsantrasyonu düşük (&lt;200 ng) Ayrıca glikojen bir taşıyıcı olarak eklenebilir. FFPE dokulardan izole DNA zaten parçalanmış ve daha fazla parçalanma deaminasyon sırasında yer aldığından daha fazla bozulmasını en aza indirmek için, bakım alınmalıdır. Parçası DNA denatürasyon önce başka etmeyin ve bisülfit reaksiyon için 4 saat inkübasyon süresi sınırı. Tasarım parçalanmış DNA nedeniyle 300 bp daha büyük amplikonlarının. PCR, unmethylated cytosines bisülfit dönüşüm DNA örneğinin karmaşıklığı azaltır etkileyebilecek bir diğer faktördür. Bölüm 4.1, artan astar uzunluğu ve nested PCR ana hatlarıyla aşağıdaki astar tasarım protokolü özgüllük ve PCR verimi artırmak için yardımcı olabilir. Son olarak, DNA örneğinin beri bisulph sırasında değişmişite dönüşüm, amplifikasyon yanlılık bir sorun olabilir. Bkz. Şekil 3, metil ve unmethylated şablonları bu orantılı PCR protokolde belirtildiği gibi, bir kontrol 50/50 M / U DNA karışımı ile işaretli olduğundan emin olun. Ayrıca sadece dönüştürülen şablonları bu amplifikasyon sağlamak HpaIII kısıtlama enzim ve jel elektroforezi (Şekil 3) ile meydana geliyor. PCR koşulları, sıcaklık ve / veya magnezyum konsantrasyonu farklı veya uzatma süresi uzatma optimize edilmesi gerekebilir. Bazı şablonlar, özellikle problemli gibi görünen ve astar konumu ayarlanması gerekebilir veya primerler dejenere kullanılmak üzere gerekebilir. Yeni nesil sıralama teknikleri genomik sıralama bisülfit benzer bir çözünürlük elde etmek için hızla gelişmektedir ve üçüncü nesil tek molekül sıralama bisülfit sıralaması için gerek kalmadan hem de birincil DNA ve metilasyon analizi için izin potansiyeline sahiptir. Ancak, yaygın kullanılabilirliği ve specbu tekniklerin ificity uzakta bir süre kalır. Bisülfit genomik sıralama metilasyon analizi altın standarttır ve sağlam bir protokoldür. Bu yöntem, sık karşılaşılan sorunlar ve sınırlamalar çözüldü noktasına kadar ilerledi ve uygulamaları, yüksek verimlilik ve Clark ve ark tarafından tanımlanan tüm genom analizi, bireysel gen analizleri genişlettik. 2006 4. Sorun Giderme kılavuzlar ve ek öneriler Tablo 1&#39;de özetlenmiştir. Başlangıçta standart bir protokol takip ve sadece eğer modifikasyon ve ne zaman bir problem ortaya tanıtmak için en uygun yaklaşım olduğu ileri sürülmektedir. <img src="/files/ftp_upload/3170/3170table2.jpg" alt="Tablo 2" /> Tablo 1 Sorun Giderme Rehberi

<ol><li> Sodyum metabisülfit (Ajax Finechem) </li><li> Hidrokinon (Merck) </li><li> Sihirbazı DNA-clean-up sistemi (Promega) </li></ol>

dna methylation: bisulphite modification and analysis

Epigenetik DNA dizisi bağımsız olarak meydana gelen kalıtsal gen fonksiyonunda değişiklikler açıklanmaktadır. Epigenetik gen düzenlemenin moleküler temeli karmaşık, ama aslında yapılan değişiklikler DNA kendisi veya DNA iştirakçi proteinler içerir. Memeli genomların DNA baskın epigenetik modifikasyon sitozin nükleotidler metilasyon (5-MEC). DNA metilasyon nerede ve gen ifade edilmelidir gen ekspresyonu makine talimat sağlar. Memeliler DNA metilasyon için birincil hedef dizisi 5&#39;-CpG-3 &#39;dinükleotidleri (Şekil 1). CpG dinükleotidleri genom boyunca eşit dağıtılmış değil, ancak tekrarlayan genomik dizileri ve gen rehberleri (Şekil 1) ile ilgili CpG &quot;adalar&quot; bölgelerinde yoğunlaşmıştır. DNA metilasyon desen doku belirli bir farklılaşma sırasında modülasyonlu, erken gelişim kurulan ve kanser de dahil olmak üzere birçok hastalık durumlarında bozulması. Understand hassas insan hastalığı, yöntemleri, verimli ve tekrarlanabilir DNA metilasyon ve rolünü biyolojik rolü 5-MeCs bireysel saptamak ve ölçmek için gereklidir. Bu protokol, bisülfit dönüşüm için DNA metilasyon analizi için &quot;altın standart&quot; ve tek nükleotid çözünürlükte DNA metilasyon tanımlanması ve ölçülmesi kolaylaştırır. Sodyum bisülfit sitozin deaminasyon kimya, üç adım (Şekil 2) içerir. (1) sülfonasyon: urasil-bisülfit türevi (3) Alkali Desulphonation vermek için ortaya çıkan sitozin-bisülfit türev hidrolitik deaminasyon:: sitozin (2) Hidrolik Deaminasyon 5-6 çift bağ için bisülfit Ayrıca sülfonat Kaldırma alkali uygulaması ile grup, urasil vermek. Bisülfit tercihen, 5-MEC ise, tek sarmallı DNA urasil sitozin deaminates bisülfit-aracılı deaminasyon dirençli. PCR üzerine, urasil yükseltilir5-MEC artıkları cytosines olarak kalırken, metil CpG&#39;ler sıralama sırasında bir sitozin &quot;C&quot; karşı timin &quot;T&quot; kalıntı varlığı unmethylated CpG&#39;ler ayırt edilmesi için izin timin gibi. Bisülfit dönüşüm tarafından DNA modifikasyonu, DNA metilasyon analizi pek çok yöntem için istismar edilebilir köklü bir protokoldür. Bisülfit dönüşüm 5-MEC algılama ilk Frommer et al 1 ve Clark ve ark. 2, DNA metilasyon yeni veri çoğunluğu için genomik DNA hesap bisülfit dönüşüm etrafında dayalı yöntemler gösterildi. Özgüllük ve gerekli metilasyon çözünürlük derecesine bağlı olarak, yazılan PCR analizi için farklı yöntemler kullanılabilir. Klonlama ve DNA molekülü üzerinde metilasyon için tek nükleotid çözünürlük verebileceğiniz en hazır yöntem.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis at JoVE.com

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

DNA metilasyon analizi için altın standart bisülfit dönüştürülen DNA genom dizileri. Bu yöntem, asidik koşullar altında deaminasyon bisülfit 5-methylcytosine (5-MEC) ile karşılaştırıldığında sitozin artan duyarlılık yararlanır. Unmethylated cytosines hedef genomik DNA PCR sonra metil cytosines ayırt edilebilir.

DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

dna-methylation-bisulphite-modification-and-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

104.1K Görüntüleme.  Garvan Institute of Medical Research. DNA metilasyon analizi için altın standart bisülfit dönüştürülen DNA genom dizileri. Bu yöntem, asidik koşullar altında deaminasyon bisülfit 5-methylcytosine (5-MEC) ile karşılaştırıldığında sitozin artan duyarlılık yararlanır. Unmethylated cytosines hedef genomik DNA PCR sonra metil cytosines ayırt edilebilir.

Video: DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

PDMS Device Fabrication and Surface Modification

PDMS Cihaz İmalat ve Yüzey Modifikasyonu

Biyoloji

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Prototip Minyatür Akış Sitometresi ve Companion mikroakışkan Karıştırma Teknoloji İndirimli-gravite Çevre Donanım Gösterileri

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.