We thank all the authors of the original ERRBS report. We thank Mame Fall for technical assistance. We acknowledge the Weill Cornell Medical College Epigenomics Core for technical services and assistance. The work was supported by a Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, an NCI K08CA169055 and ASH-AMFDP12005 to FGB, NIH R01HG006798 and R01NS076465, funding from the Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) to CEM, and an LLS SCORE grant (7006-13) to AMM.

Idam tüm işlemler Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Indiana Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Sağlık kılavuzların Ulusal Enstitüsü takip edilmektedir. 1. Cerrahi Tekniği <ol><li> Steril eldiven, aletler ve NIH kurallarına 25 göre steril cerrahi alanını kullanarak bu işlem sırasında aseptik teknik koruyun. Onları otoklav ile ameliyat başlamadan önce araçları sterilize (tam liste için özel Reaktifler / Ekipman Tablo). Operasyon sırasında araçları sterilize etmek için bir cam boncuk sterilizatör kullanın. </li></ol> 2. Anestezi ve Hazırlık <ol><li> Bir veteriner izofluran buharlaştırıcı sistemi kullanılarak 0.9 L / dk oksijen ve% 2.5 izofluran karışımı ile anestezi kutusuna fare anestezisi. Fare kutusundan çıkarmadan önce vücut pozisyonunda değişikliklere yanıt vermez emin olun. </li><li> Mou oftalmik merhem sürünSE gözleri kurumasını onları korumak için. </li><li> Burun konisi kutuya gaz akışını geçin. Koni içinde kendi burun ve ağız ile cerrahi ped ve emici tezgah kağıdı ile kaplı bir ısıtılmış pad üzerinde sol tarafta kare fare yerleştirin. Sürekli farenin solunum ritmi ve hızı izlemek ve gerektiğinde izofluran seviyelerini ayarlamak - anestezi yeterli düzeyde tutmak için (2,5 ila% 3 izofluran), toplam sedasyon onaylamak için ayak tutam refleksini kullanın. </li></ol> 3. Cerrahi Yaklaşım <ol><li> Hizalayın ve cerrahi alan ile stereoskopla odak. Burun konisi ayarlayın ve görme alanının kenarında konumlandırılmış böylece aşağı bantlayın. </li><li> Fare sol tarafta yalan, kesi yapılacaktır kulağın arkasındaki alanı açığa burun konisi sağ kulak kenarına bantlayın. Posterior aurikular ven kulağa boyunca yatay hareket emin olun. Not t doğru yerleştirmeO hayvan ve kulak bantlama hızlı yüz siniri bulmak için çok önemlidir. </li><li> Ve% 70 etanol ile kulak arkasında kürk ıslatın ve bir jilet veya neşter bıçak kullanarak cerrahi siteyi tıraş. Ön ıslatma kürk, bu anatomik konumda kolay tıraş sağlar. </li><li> % 70 etanol ile ve ardından bu Betadinede cerrahi fırçalama (% 7.5 povidon-iyot) gibi bir iyot çözeltisi ile deri temizleyin. Iyice bölgeyi dezenfekte bu temizlik iki kez daha tekrarlayın. </li><li> , Kesi yapmak kulak çıkıntı için alan posterior kaudal kulak arka aurikular ven iz yeri belirlemek için. Çıkıntı 3 mm posterior - yaylı makas kullanarak, 4 mm&#39;lik kesi 2 yapmak. </li><li> Künt diseksiyon kullanarak deri altı yağ ve fasya ile ayır. Kan damarları veya kas dokusu kolayca zarar görebilir, çünkü makas ile doğrudan kesme kaçının. </li><li> Kanama oluşursa, steril bir pamuklu çubukla cerrahi bölgeye baskı uygulamaken az 30 saniye boyunca karıştırılmıştır. Belirgin sıvı kaybı meydana gelmesi durumunda, fazla 25 ya da 27 G iğne kullanılarak steril% 0.9 tuzlu su çözeltisi 0.5 ml ile periton içine fare enjekte edilir. </li><li> Yüz siniri bulmak için, birkaç anahtar yerler, spinal aksesuar sinir, kulak kanalına kullanın ve (aşağıda açıklanmıştır) digastrik kas anterior. Fasiyal sinirin dalları görüntülenmiştir kadar bu yerler etrafında ayır. o zaman ortaya sinir önemli bir beyaz katı bir yapı olarak görünür ve fasya tabakası altında yatan yapılara bunu yapışır. <ol><li> Deri altı yağ ve fasya disseke edilmiş bir kez, trapez kasını innerve kafatası kaudal kısmından geçecek spinal aksesuar sinir, bulun. fasial sinir, spinal aksesuar sinir derin. </li><li> Inci beyazı görünüyor ve fasiyal sinirin rostralinde görülebilir kıkırdak kulak kanalı bulun. </li><li> Üst ve c yatıyor ön digastrik kas kas karın bulfasiyal sinirin için audal. </li></ol></li><li> Fasial sinirin ana dalları görüntülenmiştir zaman, Stylomastoid foramende kendi kökenini bulmak için dorsal onları iz. , Açık cerrahi siteyi tutun sinirin yolu takip bahar makas ipuçlarını ilerlemek, daha sonra açık yeni gelişmiş alan tutmak için dorsal forseps taşımak için ince uçlu Dumont forseps # 5/45 kullanma. </li><li> Bu noktada elmacık, yanak ile fasiyal sinirin gövdesini ve marjinal mandibular dalı gözünüzde canlandırın. NOT: Temporal dal foramen yakın bulunacaktır. üst ve alt bölüme marjinal mandibular sinir dalları yakın çene, böylece bu sinir dalları bu düzeyde görünür olmayacaktır. <ol><li> Bir sinir transeksiyonu performans ise, ince uçlu forseps ile yavaşça sinir stabilize ve yaylı makas ile sinir kesti. Beyin sapından sinir avulsing önlemek için forseps ile sinire çok çekiş uygulamaktan kaçının. İtBirbirlerinden uzakta, ya da kesilmiş ve distal sinir bir kısmını çıkarmadan kütükleri hiçbir yeniden bağlanma oluşabilir sağlamak için. </li><li> Bir ezilme yaralanması gerçekleştirmek, sonra, tüm aksonlar sever ilk ezilme sitesine dik ikinci bir açıyla bu ezmek tekrarlamak için sabit basınç kullanarak 30 saniye boyunca sinir sıkıştırmak için Dumont # 5/45 forseps kullanabilir. Aksi takdirde yaralanma hayvanlar arasında tutarsız olacaktır, 30 sn ezmek sırasında basınç değişken miktarlarda uygulamaktan kaçının. </li></ol></li></ol> 4. Kapanış ve Kurtarma <ol><li> Altta yatan yapıları üzerinde yağ ve kas yerleştirin. </li><li> Kesi kenarlarını yaklaştığı ve 7,5 mm yara klibi kullanarak yara kapatın. Dikişler ya da yapıştırıcı aynı zamanda yara kapatma için kabul edilebilir. Ameliyat sonrası analjezikler, şu anda temin edilebilir. </li><li> Farenin kulağına bandı çıkarın. Izofluran akışını kapatın ve fare 1 dakika 30 saniye için saf oksijen solumak için izin verir. Planestezi kurtarmak için hiçbir yatak ile boş bir kafes içinde fare ace. </li><li> Fare kurtarıldı zaman, yüz felci doğrulayıcı belirtileri için davranışlarını incelemek. bıyıkları felç ve sırt yanak doğru açılı olacak, burun sapma olacak, ve göz hava puf yanıt yanıp olmaz. </li><li> Ev hayvanlar ortaklaşa ameliyattan sonra onlar kadın iseniz. Daha agresif ve zorla enfeksiyona yol açar onların cagemate yara klipleri, kaldırmak eğilimindedir çünkü ortaklaşa erkek fareler konut kaçının. Gerekirse, şu anda cerrahi sonrası analjezik sağlayın. </li><li> Hiçbir enfeksiyon ya da diğer bir komplikasyon postoperatif meydana sağlamak için ameliyattan sonra birkaç gün günde bir defa fareler izleyin. Kendi üzerinde düşmüş değil varsa ameliyattan sonra 10 gün - yara klipleri 7 çıkarın. </li><li> Göz kırpma refleksi yeniden ya kadar günlük kornea komplikasyonları önlemek için etkilenen göze göz merhemi yağlama Uygulaörtülü veya ötenazi kadar. </li></ol>

Yazarlar ifşa etmek Çıkar çatışması var.

biyolojik-ilgili genomik bölgelerde sitozin metilasyonu protokolü sunulan verimleri baz çifti çözünürlüğü verileri. başlangıç ​​malzemesinin 50 ng için optimize edilmiş yazıldığı gibi protokol, ancak, bu, giriş malzemesi, bir dizi (5 ng ya da daha fazla) 26 işlemek için uyarlanabilir. Tablo 6&#39;da görüldüğü gibi, Bu protokol adımlar bazı ayarlamalar gerektirecektir. ERRBS kütüphaneleri de sekanslama ile gerçekleştirilebilir eşleştirilmiş uç dizisi ve daha da genomik içerisinde için uygun olan daha 51 döngü daha okur. Numune başına daha düşük maliyet protokolü sunacak Multiplexed sıralama, ancak bu verilerin (Şekil 5 ve Tablo 8) temsil CpG site başına azaltılmış kapsama neden olur, ve başına yüksek kapsama gerektiren analizler gerçekleştirmek için kapsama yeterli derinliği vermez (Landan ve ark. 33 tarafından tarif edildiği gibi) örneğin CpG Alanı. Son olarak, bu protokol (veya herhangi bir bisülfit bazlı Protocol) metil-sitozin ve hidroksimetili-sitozin 46,47 arasında ayrım yapamaz. Ancak, diğer protokol ile entegre edilebilir oluşturulan veriler, farklı değişiklikleri tanımlamak için 48,49 sonuçları ve diğer sitozin modifikasyonları son zamanlarda ilgi olmalıdır, 50 bildirdiler. Şekil 3G (kırmızı iz) her iki kütüphane fraksiyonlardan eşit mol katılım temsil gösterildiği gibi Şekil 3A-C&#39;de gösterildiği gibi, ve bir kez de sekanslama için bir araya getirilmiş bir izleme elde edilmesini sağlar, yüksek kaliteli kütüphaneleri görünür. Kütüphane hazırlık hatası prosedürü sırasında herhangi bir aşamada neden olabilir. Bozulmuş DNA işlenir Eğer bu protokolü açıklanan sıralama parametreleri kullanılarak düşük CpG kapsama dolayısıyla MspI fragmanları zenginleştirilmiş ve kütüphaneler neden olur. Bir enzim işlevsel olmayan veya yanlışlıkla reaksiyonlardan biri dışında ise, protokol beklenen kütüphane vermez. Ligasyon rea Eğerölü m, verimsizdir, adaptörler beklenenden daha yüksek bir konsantrasyonda, ve / veya kullanılan primerler konsantrasyon, son amplifıkasyonda için sınırlayıcı bir madde, kütüphane hata oluşabilir. Nedeniyle kütüphane ve aşırı adaptörler hem gelişigüzel kümelenme da sıralama ile engel olacak kütüphanede, (Şekil 3D-F Bioanalyzer sonuçlarında ~ 150 bp bir zirveleri olarak görülen) Aşırı adaptörler. Böyle bir kütüphane, görünüşe göre, normal olarak sırası da, önemli bir kısmının, sadece adaptör dizileri olacaktır okur. Aşırı adaptörler bir kütüphane gözlenir ise, bu malzeme miktarı oranları adaptör optimal girdi malzeme kullanılarak varsa kütüphane hazırlık tekrarlamak için en iyisidir. Son olarak, kütüphanelerin etkin PCR sağlamak için, alt ve üst kütüphane fraksiyonlar bisülfit dönüşüm ve PCR zenginleştirme aşamaları boyunca ayrı numune olarak muhafaza edilir. Aksi takdirde P sırasında amplifikasyon ayırıcı verimliliğini verirCR (Şekil 3G mavi iz görüldüğü gibi) daha yüksek ve daha düşük fraksiyonların reaksiyon ve sıralama sırasında her kütüphane fraksiyonu kaplı ilgili genomik loci eşitsiz temsil potansiyeli. Kullanıcı kütüphaneleri üretilen yükseltmek için gerekli optimum PCR döngüleri daha titrasyon için bisülfit dönüşüm hemen sonra kantitatif PCR adım dahil etmek tercih edebilir. ERRBS kütüphane hazırlık protokolü belirli reaktifler tavsiye edildiği birçok önemli adım vardır. Son-tamir aşamada, dört nükleotid dNTP karışımı kullanılması, MspI enzimatik yıldız aktivitesi ve orijinal DNA örneğinde bulunan kesilmiş DNA fragmanları kaynaklananlar CG çıkıntı ihtiva eden herhangi bir ürünlerin son-tamir sağlar. Bu sonuçlar gelişmiş CpG temsil sonuçlanır. Bağlama adımı azından sağlamak için, yüksek konsantrasyon ligazı (2,000,000 birim / ml) ve metilli adaptörler kullanmak kritik olduğunu ligasyon, Reactiüzerinde etkilidir ve Bisülfit dönüşümü doğru veri uyum için gerekli adaptör dizileri etki etmez. PCR adımında, bisülfit ile muamele edilen GC açısından zengin DNA fragmanlarının büyütme yeteneğine sahip bir polimeraz kullanılarak yüksek özgüllük için gereklidir. Son olarak, fazla adaptörleri ve primer eleme sağlamak için, (örneğin: Agencourt AMPure XP) SPRI boncuk arındırma ligasyonu ve PCR ürünü, izolasyonların sütun dayalı tahliller yerine tavsiye edilir. Yüksek kaliteli veri oluşturmak için, verimli bisülfit dönüşümü sağlamak için önemlidir. sunulan denetim kullanıcıya dizileme önce dönüşüm etkinliğini belirlemek için yeteneği sunar. Bir alternatif olarak, lamda DNA gibi insan dışı bir DNA, bir iç kontrol (spike Giriş) olarak kullanılabilir. Nedeniyle türlerin farklılıkları için, bir kontrol, bu tür doğrudan alt baş dizisi dahil edilebilir (örneğin Yu kullanıldığı haliyle, ve ark. 34). Ancak, başak-in i isekullanılan s, bu benzersiz büyütülmüş ve bağımsız olarak kütüphane dizileme önce dizilenmiştir sürece kütüphane sekanslama önce dönüşüm etkinliğini belirlemek için kullanılamaz. tespit dönüşüm oranları CpG olmayan bölgelerinde metilasyon durumunun dayanmaktadır. Bu (örneğin embriyonik kök hücreleri), CpG olmayan bağlam ve paralel numuneler veya bu amaç için kullanılabilir dönüşüm verimliliği için değerlendirmek başka bir şekilde yüksek sitosin metilasyon bağlamında kullanılmak üzere uygun olmayabilir. ERRBS kütüphaneleri sekanslanması için benzersiz olan adrese birkaç uyarılar bulunmamaktadır. sıralandı kütüphane fraksiyonların ilk üç üsleri nedeniyle MspI tanıma kesim sitesine neredeyse eşit olmayan rastgele (C ^ CGG Şekil 4B, C bakınız). Düşük kalite önemli veri kaybı potansiyeli Bu sonuçlar sıralama sırasında belirgin yüksek küme yoğunluğu rağmen yoksul küme lokalizasyonu kaynaklanan okur. Bu engeli aşmak için,özel kontrol şeritli olarak bağımsız bir kulvarda (phix kontrolü veya diğer kütüphane türü) yüksek karmaşıklık kütüphane bulunmaktadır. Yüksek karmaşıklık kütüphaneleri sıralandı ilk dört üsleri A, C, T ve G dengeli bir temsilini içeren uçları var. Uygun kontrol hatları, RNA-seq, ChIP-seq, tüm genom dizileme, ya da sıralama makine üreticisi (örn phix Kontrol v3) tarafından sunulan bir kontrol olarak kütüphaneler bulunmaktadır. İlgili sıralama çalıştırmak için bir kontrol şeritte olarak belirlenmiş, bu küme pozisyonları tespit etmek sıralamanın ilk dört üsleri sırasında kullanılmaktadır matris üretimi için temel olarak hizmet verebilir. yüksek kalitede tarafından CpG site başına ortalama kapsama çıkaracağız yakalanan okur 5.2 (n = 4). Seçenek olarak ise, bu teknik bir sorun, aynı zamanda, daha önce tarif edildiği gibi 23 koyu dizilim yaklaşımı kullanılarak aşılabilir. Diğer sıralama kriterleri üreticinin protokolleri başına standart operasyon prosedürlerini izleyin. CpG c başına Nihayet, kapsamaVeri analizi için hosen ilgi biyolojik soruların kullanıcı tarafından ve kısmen yönlendirileceksiniz. 10x kapsama eşiği yüksek kapsama analizi yaklaşımı, ancak bu eşik bu ilgi olmalıdır düşürülebilir tanıyor. ERRBS veri analizi tam bir tartışma, ancak farklı şekilde metilatlı sitozinler ve bölgeler açık kaynak araçları 31,51-53 kullanılarak tespit edilebilir, bu makalenin kapsamı dışındadır. Ek analiz düşünceler ve yaklaşımlar 54,55 iyi tarif edilmiştir, ve okuyucu planlanan analize en uygun araçlar için literatür taraması teşvik edilmektedir. Diğer yayınlanmış yöntemlere kıyasla, ERRBS tekrarlanabilirliği açıklanan verim yüksek oranlı olarak gerçekleştirilen dört günlük protokolünü sunmaktadır. Bu MassARRAY EpiTYPER 26 standart altın oranla onaylanmıştır, maliyet-etkin, yüksek kapsama veri ve çeşitli giriş malzeme için uyarlanabilirve sıralama yaklaşımlar (düşük frekanslı klinik örnek işleme ve diğer hücre tipleri için uygun) tutarlar. Bu genom bağlayıcı transkripsiyon faktörü, kromatin remodeling, epigenetik işaretleri ve diğer ilgi sitozin değişiklikler profilleme diğer tekniklerle analiz biyolojik ilgili loci taban çifti çözünürlük sunuyor ve bütünleştirici kullanılabilir. Bu çalışmalarda ERRBS veri kullanımı geniş kapsamlı bir moleküler yaklaşım katkı ve boyutsal biyolojik modellerinde ve insan hastalığının çalışmada analizi yüksek olanak sağlayabilmektedir.

Sitosin (5-metilsitosin) DNA metilasyonu, biyolojik süreçlerin çeşitli memeli hücrelerinde önemli dahil, ancak baskılı X kromozomu inaktivasyonu, geliştirme ve gen ifadesinin 1-8 düzenlenmesi ile sınırlı değildir epigenetik işaretidir. Malign ve diğer bozukluklar DNA metilasyon desen çalışması hastalığa özgü desenleri tespit ve hastalık patogenezinde ve potansiyel biyomarker keşifler 9-17 anlayışına katkıda bulunmuştur. DNA metilasyonu durumu epigenom sorguya birçok protokol vardır. Bu afinite göre ayrılabilir, kısıtlayıcı enzim bazlı ve aşağı mikrodizi veya sıralama platformları kullanan Bisülfit dönüşümü-ölçülür. Ayrıca, bu genel kategoriler de dahil olmak üzere, ancak, Kombine bisülfit Kısıtlama Analizi 18 ile sınırlı ve Temsil bisülfit sıralamayı (RRBS 19) İndirimli olmayan köprü, birkaç protokoller vardır. </p&gt; RRBS başlangıçta Meissner et al. 19,20 tarafından tarif edilmiştir. protokol maliyeti 21,22 etkilidir nicel baz çifti çözünürlük verileri sonuçlandı bisülfit sıralama, ardından GC-zengin genomik bölgeleri zenginleştirmek için bir adım tanıttı. GC-zengin bölgeler MspI (C ^ CGG) kısıtlama enzimi tarafından hedeflenen, ve sitozin metilasyonu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu ardından sitosinlerin bisülfit dönüşüm (urasile değiştirilmemiş sitosinlerin Deaminasyon), tarafından çözümlenir. RRBS gen promoterleri ve tüm genom sekanslama için gerekli bir kısmını CpG adalarının kısmını içermektedir; Ancak RRBS CpG kıyıları ve biyolojik alaka diğer arası bölgelerde sınırlı kapsama vardı. Çeşitli gruplar bu genomik bölgelerin 23-25 ​​metodoloji ve sonuç kapsama üzerine geliştirmek orijinal rapordan bu yana RRBS protokolleri güncellendi yayınladı var. Geliştirilmiş İndirimli Temsil bisülfit aşağıya bakınızencing (ERRBS) RRBS göre kütüphane hazırlık değişiklikler ve alternatif veri uyum yaklaşımı 26 içermektedir. ERRBS üretilen veriler temsil CpG&#39;lerin daha yüksek bir sayısı ile sonuçlandı ve genomik bölgelerinin kapsamı 26 sorguya artmıştır. Bu yöntem, insan hastaya ve diğer hayvan örneklerinde 26-30 DNA metilasyon modelleri gidermek için kullanılmıştır. ERRBS protokolü tamamlanması ve temsili insan DNA&#39;sı kullanılarak oluşturulan veriler için gerekli adımlar teklifleri ayrıntıları tarif edildiği gibi (örnekler, daha önce rapor de tanımlanan hasta numunelerinin 31 elde edilir ve normal bir insan vericiden bir CD34 + kemik iliği numunesi edildi). Protokol numune başına işleme süresini azaltır ve kütüphane büyüklüğü seçiminde fazla ayrıntı için sağlayan otomatik bir boyut seçim süreci içerir. Protokol, bilinen moleküler biyoloji teknikleri, bir dizi bir araya getirir. Yüksek molekül ağırlıklı DNA ağırlık sindirilirson-tamir A-atık ve metillenmiş bağlanmasının ardından metilasyona duyarlı restriksiyon enzimi (MspI) i. GC açısından zengin parçalarının boyutları seçimi bisülfit dönüşümü ve dizileme için önceki PCR tarafından takip edilir. Bisülfit dönüşüm önce yapılmış 32 tarif ve veri analizi ve uygulamaları detaylı yorum öneriler ve referanslar okuyucuların kullanımı için dahil edilir, ancak bu yazının kapsamı, ötesinde olmuştur. protokol, dört gün boyunca yapılan ve küçük girişi (50 ng veya daha az) malzeme miktarlarına müsait olabilir. diferansiyel metilasyon Alanı ve bölgesi belirlemeleri için değil, aynı zamanda epigenetik polimorfizm tespiti için sadece yeterli CpG site başına yüksek içerisinde tarif edilen verimler veri olarak protokol ve ark. 33 Landan tarafından tarif edildiği gibi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:193px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:497px;">URL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">MspI</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">R0106M</td>
			<td style="width:193px;">100,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/r0106-mspi</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">NEBuffer 2</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">B7002S</td>
			<td style="width:193px;">Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b7002-nebuffer-2</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:269px;">Phenol solution</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P4557</td>
			<td style="width:193px;">Equilibrated with 10&#160;mM Tris HCl, pH&#160;8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:269px;">Chloroform</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C2432</td>
			<td style="width:193px;">See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Glycogen</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">G1767</td>
			<td style="width:193px;">19-22 mg/ml</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g1767</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">NaOAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td style="width:193px;">3M pH 5.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s7899</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E7023</td>
			<td style="width:193px;">200 proof, for molecular biology</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e7023</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Buffer EB</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">19086</td>
			<td style="width:193px;">10 mM Tris-Cl, pH 8.5</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/buffer-eb</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T1503</td>
			<td style="width:193px;">prepare a 1M pH 8.5 solution</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t1503</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE)</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T9285</td>
			<td style="width:193px;">Dilute to 1X buffer solution per manufacturer&#39;s recommendations</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9285</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">B0202S</td>
			<td style="width:193px;">10X concentration</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">N0447L</td>
			<td style="width:193px;">10 mM each nucleotide</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n0447-deoxynucleotide-dntp-solution-mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0203L</td>
			<td style="width:193px;">3,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0210L</td>
			<td style="width:193px;">5,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0210-dna-polymerase-i-large-klenow-fragment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0201L</td>
			<td style="width:193px;">10,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0201-t4-polynucleotide-kinase</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">28104</td>
			<td style="width:193px;">Used for DNA product purification in protocol step 2.3</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-pcr-purification-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2&#39;-deoxyadenosine 5&#39;-triphosphate (dATP)</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">U1201</td>
			<td style="width:193px;">100 mM</td>
			<td style="width:497px;">http://www.promega.com/products/pcr/routine-pcr/deoxynucleotide-triphosphates-_dntps_/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0212L</td>
			<td style="width:193px;">5,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0212-klenow-fragment-3-5-exo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">28004</td>
			<td style="width:193px;">Used for DNA product purification in protocol step 3.3</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/minelute-pcr-purification-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202M</td>
			<td style="width:193px;">2,000,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0202-t4-dna-ligase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Methylation Adapter Oligo Kit</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td style="width:104px;">ME-100-0010</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:269px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:153px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">A63881</td>
			<td style="width:193px;">Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use</td>
			<td style="width:497px;">https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcr-purification/index.htm?i=A63882#2/10//0/25/1/0/asc/2/A63882///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free</td>
			<td style="width:153px;">Sage Science</td>
			<td style="width:104px;">CDF2010</td>
			<td style="width:193px;">with internal standards</td>
			<td style="width:497px;">http://store.sagescience.com/s.nl/it.A/id.1036/.f</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Certified Low Range Ultra Agarose</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-3106</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.bio-rad.com/en-us/sku/161-3106-certified-low-range-ultra-agarose</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4415</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4415</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td style="width:193px;">10 mg/ml</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e1510</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n3236-50-bp-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n3231-100-bp-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel Loading Dye, Orange (6X)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7022S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b7022-gel-loading-dye-orange-6x</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpel&#160;Blade&#160;No.&#160;11</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?position=content&#38;tab=Items&#38;productId=11876776</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-gel-extraction-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:104px;">D5001</td>
			<td style="width:193px;">Used in protocol step 6.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-kits/ez-dna-methylation-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:104px;">D5030</td>
			<td style="width:193px;">Alternative for step 6.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-lightning-kit</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">Universal Methylated Human DNA Standard</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td>D5011</td>
			<td style="width:193px;">Used as bisulfite conversion control</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/methylated-dna-standards/universal-methylated-human-dna-standard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">FastStart High Fidelity PCR System</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">03553426001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://lifescience.roche.com/shop/products/faststart-high-fidelity-pcr-system#tab-0</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:269px;">Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td style="width:153px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">Q32854</td>
			<td style="width:193px;">A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1</td>
			<td style="width:497px;">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32854</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:153px;">Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12321D</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:153px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:104px;">5067-4626</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-DNA-RNA-Kits/High-Sensitivity-DNA-Analysis-Kits/?cid=AG-PT-105&#38;tabId=AG-PR-1069</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:153px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106&#38;tabId=AG-PR-1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">PhiX Control v3</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/phix_control_v3.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">HiSeq 2500</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pippin Prep</td>
			<td style="width:153px;">Sage Science</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.sagescience.com/products/pippin-prep/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32872</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32872</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>GD-401-3001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/truseq_sr_cluster_kit_v3-cbot-hs.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq SBS Kit v3-HS</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-401-3002</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/truseq_sbs_kit_v3-hs.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">TruSeq RNA Sample prep</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td style="width:193px;">Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol</td>
			<td style="width:497px;">http:/http://www.illumina.com/products/truseq-rna-access-kit.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Block Heater</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Gel electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Electrophoresis power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Gel doc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">UV or blue light transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced reduced representation bisulfite sequencing for assessment of dna methylation at base pair resolution

DNA metilasyon motifi eşleme ağır normal ve hastalıklı dokularda incelenmiştir. Çeşitli yöntemler hücrelerinde sitozin metilasyonu desenleri sorgulamak için kurulmuştur. Tüm genom dizileme bisülfit İndirimli temsil GC-zengin genomik loci nicel baz çifti çözünürlüğü sitozin metilasyonu kalıplarını tespit için geliştirilmiştir. Bu bisülfit dönüşümü, ardından, bir kısıtlama enzimi kullanımını birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Geliştirilmiş Düşük Temsil bisülfit dizileme (ERRBS) kapalı biyolojik ilgili genomik lokusları arttırır ve insan, fare ve diğer organizmalardan DNA sitozin metilasyonu profil kullanılmıştır. ERRBS kütüphanesi hazırlanmasında kullanım için, düşük molekül ağırlıklı parçaları üretmek için DNA, sınırlama enzimi özümlemesi ile başlatılır. Bu parçalar, yeni nesil dizileme için standart kütüphane yapımı tabi tutulur. Nihai amplificati önce metillenmemiş sitozinlerin bisülfit dönüşümüadım kapalı genomik loci sitozin metilasyon seviyelerinin nicel taban çözünürlüğü sağlar. protokol dört gün içinde tamamlanabilir. Belirlenmiş bir dizilim kontrol şeridini kullanarak sıralandı ilk üç üsleri düşük karmaşıklık rağmen, ERRBS kütüphaneleri yüksek kaliteli veri elde. Haritalama ve biyoinformatik analizi, daha sonra yapılır ve verim verileri kolayca genom platformlarda çeşitli entegre edilebilir. ERRBS bu mümkün araştırma uygulamaları bir dizi insan klinik örnekleri ve uygulanabilir işlemek için yapım küçük giriş malzeme miktarlarını kullanabilir. üretilen bir video ERRBS protokol kritik adımları gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution at JoVE.com

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Baz Çifti Çözünürlük DNA metilasyon Değerlendirme Temsil bisülfit sıralamayı İndirimli pekiştirilmiş

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

enhanced-reduced-representation-bisulfite-sequencing-for-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K Görüntüleme.  Weill Cornell Medical College. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Video: Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Biyoloji

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Baskılı Genler DNA metilasyon Belirlenmesi Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Prototip Minyatür Akış Sitometresi ve Companion mikroakışkan Karıştırma Teknoloji İndirimli-gravite Çevre Donanım Gösterileri

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

ChIP-ekzo Yöntem: Base Çifti Hassas Protein-DNA Etkileşimleri belirlenmesi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

Yüksek İşlem Likör Sıralaması Için Gram-Negatif Bakterilerde Transposon Ekleme Kitaplıkları Oluşturma

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...