Bu yöntem, bilim adamları için kadın üreme sistemi içinde kendi doğal ortamlarda sperm göçü ve davranışını etkileyen çevresel genetik faktörler irdelemek için bir araç sağlar. Bu tekniğin en büyük avantajı, deneycilerin canlı hayvanlardaki sperm hareketini kolayca görselleştirmelerine ve kaydetmelerine olanak tanıyan C.elegans'ın saydam epidermisinden kaynaklanmaktadır. Başlamak için, 20-30 L4 sahne hermafroditleri almak ve yavaşça altı santimetre tohumlu NGM plaka üzerine yerleştirmek için bir ucunda düzleştirilmiş bir Pasteur pipet ve platin tel yapılmış bir solucan toplama kullanın.
Hermafroditleri 20 derecede 28-30 saat kuluçkaya yatırın. Sonra, bir erkek boyama plakası yapmak. Bir tohumlu plaka bakteri çim E.coli kazımak için bir cam karıştırma çubuk ucunu kullanın ve tohumsuz bir NGM plaka merkezine yatırmak, beş ila yedi milimetre çapında gıda nokta yapma.
DMSO'da iki mikrolitre bir milimolar mito-boya ve mikrosantrifüj tüpünde 10 mikrolitre M9 tamponu karıştırın. Pipet tüm mito-boya çözeltisi erkek boyama plakası üzerinde gıda nokta üzerine. 30 dakika kuruması için karanlıkta plaka yerleştirin.
Mikroskop altında, bir-üç günlük yetişkin C.elegans içeren bir plaka üzerinde, onların fan şeklinde kuyruk erkekleri tanımlamak. Erkek boyama plakası üzerinde mito-boya lekeli gıda nokta yaklaşık 100 erkek seçin. Plakayı alüminyum folyoya sarın ve bir gecede 16 santigrat derecede kuluçkaya yat.
İkinci gün, lekeli erkekleri aşırı mito-boya lekeli bakterileri temizlemek için yeni bir seri başı NGM plakasına aktarın. Kenetleyene kadar tabağı karanlıkta tutun. Bir çiftlik plaka yapmak için, tohumsuz bir NGM plaka üzerinde, kalın E.coli karışımı iki mikrolitre damla.
Bir miyeslik nokta oluşturmak için kalın bakterilerin kuruması için yaklaşık 10 ila 15 dakika bekleyin. Mijat plakasının kurumasını beklerken, hacim trikatına göre %1 ağırlıkta 300 mikrolitre, hacim tetramisole tarafından %0,1 ağırlıkta 300 mikrolitre ve 900 mikrolitre M9'u karıştırın. Tetramisole/tricaine çözeltisinin 600 mikrolitresini bir saat bardağına aktarın. İlk gün topladığı 12-15 hermafroditi saat camındaki tetramisole/tricaine çözeltisine aktarın.
Petri kabının alt yarısını, buharlaşmadan korumak için saat camının üzerine yerleştirin ve hermafroditleri etkisiz hale getirmek için 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, karanlıktan lekeli erkek içeren tohumlu NGM plaka almak ve çiftleşen plaka üzerinde kurutulmuş çiftleşen nokta üzerine 50-60 lekeli erkek almak. Tabağı karanlıkta saklayın.
Hermafroditler hareketsiz hale geldikten sonra, saat camından hareketsiz hermafroditleri almak için cam pasteur pipetkullanın. Pipetin dar kısmının ötesinde hermafroditleri emmekten kaçının. Hermafroditleri tohumsuz bir NGM plakasına aktarın.
Mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın ve aşırı sıvı kuru izin. Görünür olan tüm sıvı buharlaşır buharlaşmaz, anesteziye uğramış hermafroditleri lekeli erkeklerle çiftleşme dot'una aktarın. 30 dakika boyunca karanlıkta kuluçkaya yatarak mikreyime izin verin.
Sperm dağılımı değerlendirmesi isteniyorsa, çiftleşen hermafroditleri tohumlu bir NGM levhasına aktarın ve görüntüleme için monte edilmeden önce bir saat dinlenmelerine izin verin. Solucanları görselleştirme için monte etmek için, ilk olarak tetramisole/tricaine çözeltisinin 10 ila 15 mikrolitresini hazırlanan %2'lik agarose pedin üzerine damlatın ve çiftleştirilmiş hermafroditleri ped üzerindeki çözeltiye aktarın. Solucanların üzerine bir kapak kaydırın.
Slaytı epifloresans ile donatılmış dik bir mikroskoba yerleştirin ve solucanı hem vulva hem de bir spermatheca görünümünde olacak şekilde konumlandırın. Spermatheca merkezine odaklanarak görüntü odaklanın. Hem DIC hem de TRITC kanallarının pozlamasını kontrol edin.
DIC'de iç solucan yapıları açıkça görülebilir. TRITC'de, bireysel spermler farklı puncta olarak görülebilir. Her rahim için DIC ve floresan görüntüleri edinin.
Zaman atlamalı videoları yakalamak için, ilk rahim içinde etiketli sperm içeren hermafroditler bulmak. Edinme panelinde, görüntü edinme aralıklarını 15-30 saniyeye, süreyi ise rahim başına 10-20 dakikaya ayarlayın. Ardından, DIC ve TRITC kanallarında hızlandırılmış görüntüler elde etmek için Çalıştır'ı tıklatın.
Bir ucunda vulva ve diğer spermatheca ile başlayarak, üç bölgeye rahim bölmek, vulva ve spermatheca içeren bölge üç ile. Elle rahim her üç içinde sperm sayısını saymak ve tüm rahim toplam sperm yüzdesi olarak her bölgede sayısını rapor. Gerekirse, tritc kanal görüntülerinin sinyal yoğunluğunu ayarlamak için arama tablosunu kullanın, böylece her sperm görünür ve ölçülebilir.
Zaman atlamalı görüntülerde sperm izlemek için, analiz için Fiji yazılımı kullanın. Görüntüleri tek bir hiperyığın olarak bir zaman atlamalı seriden almak için Bio-Formats Alma işlevini kullanın. Ardından Eklentiler, İzleme ve ardından Manuel İzleme'yi tıklatın.
Açılan iletişim kutusunda, Fiji araç çubuğundaki TrackMate aracını seçin. İzlenecek sperme çift tıklayın. Kesik çizgilerle görünen yeşil dairenin içine tıklayın ve istediğiniz konuma sürükleyin.
Daireye tekrar tıklayın. Kesikli yeşil çizgi düz yeşil bir çizgidönüşür. Aynı anda izleme modunu açmak için Shift ve L tuşlarına basın.
Hızlandırılmış serideki bir sonraki kareye geçin. İzlenen spermin yeni konumunu yeni çerçevede ayarlamak için fareyi yeni noktanın üzerine yerleştirin ve A tuşuna basın. İzleyici yeni konumda görünür ve izleyicinin önceki çerçeveye yerleştirildiği konumu bağlayan bir satır görüntülenir.
Çerçevelerin geri kalanı için aynı yordamı tekrarlayın. İzlemeler tamamlandıktan sonra, gerekli verileri oluşturmak için TrackMate iletişim kutusunda Çözümle'yi tıklatın. Hızı hesaplamak için, spermin toplam yol uzunluğunu geçen süreye bölün.
Vektörel hızı hesaplamak için, vulvadan başlayarak spermatheca'yı işaret ederek rahimden bir çizgi çekin. İzlemenin başından sonuna kadar spermin bu çizgi boyunca göç ettiği mesafeyi ölçmek için Line aracını kullanın. Bu mesafeyi geçen süreye bölün.
Negatif değerler spermin spermatheca'dan uzaklara göç ettiğini gösterir. Geri dönüş frekansını kaydetmek için, sperm izinin art arda üç zaman atlamalı kare de 90 dereceden daha az bir açı ürettiği kaç kez sayın. Bu protokolde, sis-2 q71 erkek solucanlar mito-boya ile boyanmış ve yabani tip N2 hermafroditler çiftleştirilmiş.
Yetişkin hermafrodit üreme yolu birbirlerinin ayna görüntüleri olan iki kol vardır. Mite üzerine, etiketli sperm vulva ile hermafrodit rahim de birikintisi vardır. Spermler rahim içinde gelişmekte olan embriyoların etrafında, spermatheca doğru hareket, onlar döllenme kadar saklanır nerede.
Hermafrodit uterus sperm dağılımı ve göçünü ölçmek için üç bölgeye ayrılmıştır. Sperm hızını ve geri dönüş sıklığını değerlendirmek için, sadece ikinci bölgede sperm ler zaman atlamalı görüntülerle izlendi. Birinci bölgede bulunan spermler vulvadan başlayarak ve spermatheca da dahil olmak üzere üçüncü bölge dairesel bir şekilde hareket etme eğilimindedir.
Kırmızı ve mavi noktalarla işaretlenmiş spermlerin sperm hızı ve ters frekansı ölçüldü. Rahimdeki sperm dağılımı ölçülürken, yabani tip N2 hermafroditler ve sis-2 q71 erkekler kullanılarak uygun sperm yönlendirmesi, etiketli spermin yaklaşık %90'ının spermatheca'ya ulaşmasına neden oldu. Eğer sperm, rahimde çok az sperm veya rahimde çok fazla sperm le sonuçlansa ve her yarığı dolduruyorsa veriler sayılmamalıdır.
Hayvanların her transfer adımında hafifçe ele alınması, hermafroditlerin tamamen hareketsiz hale getirilmiş olması ve miyo-boya içeren tabakaların ve solucanların ışıktan korunması önemlidir. Bu yöntem, sperm göçlerini düzenleyen faktörleri belirlemek için gen nakavt veya nakavt deneyleri, çevresel veya kimyasal maruzkalma deneyleri veya diğer manipülasyonlarla birleştirilebilir. Bu teknik bize yumurta sperm rehberlik için önemli olan belirli prostaglandinler belirlemek için sağlamıştır.
Bu prostaglandinler yüksek memelilerde korunabilen alışılmadık bir mekanizma ile sentezlenirler. Tetramisole, triain, DMSO deri ve göz tahriş edicidir ve yüksek dozlarda toksik etkileri olabilir. Herhangi bir kimyasalı kullanırken uygun koruyucu giysilerin kullanılması önemlidir.
