Таким образом, главное преимущество нашей новой техники, которую мы назвали E plus E, которая выступает за обогащение плюс расширение, заключается в том, что мы можем обогатить и расширить эти клетки, редкие антиген-специфические клетки, одновременно. Это позволяет нам развивать достаточное количество клеток, которые мы собираемся быть в состоянии использовать для исследования их роли в различных условиях и в различных клинических условиях или даже позволяет нам развивать сейчас большое количество клеток, которые мы можем использовать для иммунотерапии таким образом, что мы не могли раньше. Метод, который мы разработали, это E плюс E, может помочь ответить на ключевые вопросы в основной иммунологии о присутствии неоэпитопов.
Что такое неоэпитопы? Таковы персонализированные эпитопы, которые мы знаем, в настоящее время очень важны с точки зрения иммунотерапии рака, а также антиген-специфической динамики и как эти факторы влияют на состояния заболеваний и для эффективной клеточной терапии. Последствия этого метода распространяются на иммунотерапию, так как наночастицы искусственных антиген-представляя клеток может быть готовый продукт, который легко с учетом индивидуальных иммунных реакций пациента.
Для генерации наночастиц искусственных антиген-представляя клеток, повторно лиофильных частиц в один миллилитр буфера повторного незаменимия и энергично вихрем подвески, по крайней мере 15 минут, пока не агрегаты видны. Частицы, недостаточно вихревые и перерасходуемые до реакции с белком, приведут к более крупным агрегированным частицам, которые не могут быть разобщены. Поместите магнитные частицы на магнитный стенд, чтобы удалить супернатант и повторно использовать их с 0,5 миллилитров свежего буфера повторного незаменимости.
Перенесите суспензию частицы в стеклянный сцинтилляционный флакон для вихря до тех пор, пока не будут видны агрегаты, и добавьте 0,1 миллиграмма общих стимулирующих сигналов на один миллиграмм перерасходующих частиц. После вихря, позвольте подвеске реагировать в течение 2,5 часов при комнатной температуре с смешиванием в ротаторе, а затем добавление 0,1 миллилитров утоляющий буфер для дополнительного 30-минутного инкубации при комнатной температуре с смешиванием. В конце второй реакции поместите флакон сцинтилляции на магнитный стенд и помойте частицы в один миллилитр буфера повторного незаменимия четыре раза, удалив буфер, когда станет ясно после каждой стирки, и заменив его свежим буфером повторного незаменимости для последующего мытья на магните.
После последней стирки, аспирировать раствор и удалить частицы из магнитного стенда, а затем хранить частицы в один миллилитр свежего буфера повторного получения на четыре градуса по Цельсию на срок до шести месяцев. Чтобы изолировать антиген-специфические клетки CD8'T, macerate селезенки и лимфатических узлов от дикого типа C57 черный 6J мышей через стерильные, 70-микрометровый штамм клеток с частыми полосканиями PBS и использовать без касания CD8'T изоляции комплекта в соответствии с инструкциями производителя по устранению не-CD8'T клеток. После подсчета, собирать изолированные клетки CD8'T центрифугации и повторно гранулы в 100 микролитров PBS дополнены 0,5%Bovine сыворотки Альбумин и двухмилимолярный ЭДТА, затем инкубировать клетки с наночастицами искусственных антиген-представляя клеток таким образом, что Есть один раз от 10 до 11-го пептида загружены MHC-ig в один раз от 10 до шестого изолированных клеток CD8'T в стерильных , пятими миллилитровый полистирол круглого дна трубки в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию с постоянным смешиванием.
В конце инкубации, мыть наночастицы клеточной подвески три раза на магнитном стенде, как попродемонстрировано, resuspending искусственных антиген-представления клеток и обогащенных клеток CD8'T в 500 микролитров свежих, дополненных среды с 1%T фактор роста клеток после последней стирки. Для максимального восстановления клеток крайне важно оставить частицы и клетки на магнитной колонке, по крайней мере, на две минуты и аспирировать буфер тщательно, не нарушая частиц и клеток, подлежащих магнитному полю. После подсчета, семена 2,5 раза от 10 до пятого обогащенного CD8'T клеток и магнитных частиц смеси на 160 микролитров дополненной среды плюс 1%TCGF в 96-хорошо U-нижней пластины.
На третий день, кормить клетки с 80 микролитров дополненной среды с 2%T фактор роста клеток на колодец и вернуть пластину в инкубатор культуры клеток в течение еще четырех дней. На седьмой день, урожай стимулировали клетки в пятими миллилитрового круглого дна трубки для подсчета и сбора клеток центрифугации. Resuspend гранулы в 0,5 миллилитров PBS дополняется 0,05% натрия азида и 2% плода бычьей сыворотки для подсчета и aliquot пять раз от 10 до 4 до 5 раз от 10 до пятой клетки в новые пятими миллилитровые круглые дном трубки для антиген-специфического окрашивания.
Этикетка соответствующих труб с биотинилированным MHC-ig и анти-мышь CD8a в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию, затем центрифуги мыть в свежем PBS, чтобы удалить излишки биотинилированного иммуноглобулина, затем пятно образцов с соответствующим стрептавидин-конъюгированных вторичных антител и соответствующих живых мертвых фиксируемых мертвых клеток штамма в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию и читать клетки на поток цитометра, чтобы определить специфику и количество антиген-специфических клеток CD8.T в соответствии со стандартными протоколами. Здесь успешное спряжение белка было достигнуто с помощью трех различных методов привязанности белка к частицам. Если плотность лиганда aAPC слишком низка, не будет эффективной стимуляции антиген-специфических клеток CD8-T.
Контроль качества биотинилированного димера может быть завершен на трансгенных клетках CD8-T для проверки окрашивания. Например, эти репрезентативные результаты демонстрируют положительное окрашивание с gp100-специфическими клетками CD8-T с не-антиген-специфическими клетками b6 CD8-T в качестве фонового контроля. Кроме того, знание фонового окрашивания биотинилированного димера имеет решающее значение, так как любой процент ниже, чем это окрашивание в cognate окрашенных труб следует рассматривать как отрицательный результат.
После семи дней обогащения и расширения, от двух раз от 10 до четвертого и два раза от 10 до пятого антигена конкретных и от пяти до 50%CD8'T клеток можно ожидать от первоначального пять раз 10 до шестой эндогенной CD8-T ячейки, начиная населения. Та же методология может быть использована для изоляции и стимулирования человеческих антиген-специфических клеток CD8-T с аналогичным увеличением в процентах и количестве антиген-специфических клеток CD8'T наблюдается только после одной недели расширения после обогащения. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы выполнить соответствующие проверки качества реагентов, как описано.
После этой процедуры, другие методы, такие как цитометрия потока для внутриклеточного окрашивания цитокинов или экспрессии поверхностного белка могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о функциональности или фенотипе клеток. Этот метод прокладывает путь для исследователей в области базовой иммунологии, чтобы исследовать широту, глубину и динамику антиген-специфических ответов в других биомедицинских областях, таких как рак, инфекционные заболевания, или аутоиммунные исследования.
