Assim, a principal vantagem da nossa nova técnica, chamamos de E plus E, que significa enriquecimento mais expansão, é que podemos enriquecer e expandir essas células, células raras específicas de antígeno, simultaneamente. Isso nos permite desenvolver um número suficiente de células que poderemos usar para investigar seu papel em diferentes cenários e em diferentes ambientes clínicos ou mesmo nos permite desenvolver agora um grande número de células que podemos utilizar para a imunoterapia de uma forma que não poderíamos antes. O método que desenvolvemos, este E plus E, pode ajudar a responder perguntas-chave na imunologia básica sobre a presença de neoepitopes.
O que são neoepitopes? Esses são os epítopos personalizados que sabemos que são agora muito importantes em termos de imunoterapia contra o câncer e também dinâmicas específicas de antígenos e como esses fatores afetam os estados da doença e para uma terapia celular eficaz. As implicações dessa técnica se estendem para a imunoterapia, já que a célula de apresentação de antígeno artificial nanopartícula pode ser um produto fora da prateleira que é facilmente adaptado para respostas imunes individuais do paciente.
Para gerar células de apresentação de antígeno artificial nanopartículas, resuspende as partículas liofilizadas em um mililitro de tampão de resuspensão e vigorosamente vórtice da suspensão por pelo menos 15 minutos até que nenhum agregado seja visível. Partículas não suficientemente vórtices e resuspendadas antes da reação com proteína resultarão em partículas agregadas maiores que não são capazes de ser dissociadas. Coloque as partículas magnéticas em um suporte magnético para remover o supernasciente e resuspensá-las com 0,5 mililitros de tampão de resuspensão fresco.
Transfira a suspensão de partículas para um frasco de cintilação de vidro para vórtice até que não sejam visíveis, e adicione 0,1 miligramas de sinais estimulatórios totais por um miligrama de partículas resuspended. Após o vórtice, permita que a suspensão reaja por 2,5 horas em temperatura ambiente com a mistura em um rotador, seguida pela adição de 0,1 mililitros de tampão para uma incubação adicional de 30 minutos à temperatura ambiente com mistura. No final da segunda reação, coloque o frasco de cintilação no suporte magnético e lave as partículas em um mililitro de tampão de resuspensão quatro vezes, removendo o tampão quando ele fica claro após cada lavagem e substituindo-o por tampão de resuspensão fresco para a lavagem subsequente no ímã.
Após a última lavagem, aspire a solução e remova as partículas do suporte magnético, em seguida, armazene as partículas em um mililitro de tampão de resuspensão fresco a quatro graus Celsius por até seis meses. Para isolar as células CD8+T específicas do antígeno, macerar os baços e os linfonodos de ratos pretos C57 pretos 6Js tipo selvagem através de um coador de células estéril de 70 micrômetros com enxaguaduras frequentes de PBS e usar um kit de isolamento celular CD8+T sem toque de acordo com as instruções do fabricante para eliminar as células não-CD8+T. Após a contagem, colete as células isoladas CD8+T por centrifugação e resuspenja a pelota em 100 microliters de PBS suplementados com Albumina de soro bovino de 0,5% e EDTA de dois mililitros, em seguida, incubar as células com as células de presente de antígeno artificial nanopartículas de tal forma que há uma vezes 10 para o 11º MHC-ig carregado de peptídeo por uma vez 10 a sexta células CD8+T isoladas em um estéril , tubo de poliestireno de cinco mililitros por uma hora a quatro graus Celsius com mistura contínua.
No final da incubação, lave a suspensão das células nanopartículas três vezes no suporte magnético como demonstrado, reutilizando as células que apresentam antígeno artificial e as células CD8+T enriquecidas em 500 microliters de meio fresco e suplementado com fator de crescimento celular 1%T após a última lavagem. Para a recuperação máxima das células, é fundamental deixar as partículas e células na coluna magnética por pelo menos dois minutos e aspirar o buffer cuidadosamente sem interromper as partículas e células sujeitas ao campo magnético. Após a contagem, sementes 2,5 vezes 10 para a quinta células CD8+T enriquecidas e mistura de partículas magnéticas per 160 microliters de meio suplementado mais 1%TCGF em uma placa de fundo U de 96 poços.
No terceiro dia, alimente as células com 80 microliters de meio suplementado com fator de crescimento celular 2%T por poço e devolva a placa à incubadora de cultura celular por mais quatro dias. No sétimo dia, colde as células estimuladas em um tubo de fundo redondo de cinco mililitros para contagem e coleta das células por centrifugação. Resuspend a pelota em 0,5 mililitros de PBS suplementados com azida de sódio de 0,05% e soro bovino fetal de 2% para contagem e alíquota cinco vezes 10 para a quarta a cinco vezes 10 para as quintas células em novos tubos de fundo redondo de cinco mililitros para coloração específica de antígeno.
Rotule os tubos apropriados com MHC-ig biotinilado e CD8a anti-rato por uma hora a quatro graus Celsius, seguido por uma lavagem de centrífuga em PBS fresco para remover qualquer excesso de imunoglobulina biotinitada, em seguida, manchar as amostras com um anticorpo secundário conjugado streptavidin apropriado e uma tensão celular morta reparável adequada por 15 minutos a quatro graus Celsius e ler as células em um citômetro de fluxo para determinar a especificidade e o número das células CD8+T específicas de antígeno de acordo com os protocolos padrão. Aqui, uma conjugação proteica bem sucedida foi alcançada usando três métodos diferentes de apego proteico às partículas. Se a densidade de ligantes aAPC for muito baixa, não haverá uma estimulação eficaz das células CD8+T específicas do antígeno.
O controle de qualidade do dimer biotinilado pode ser concluído em células CD8+T transgênicas para verificar a coloração. Por exemplo, esses resultados representativos demonstram uma coloração positiva com células CD8+T específicas do GP100 com células b6 CD8+T não específicas de antígeno como controle de fundo. Além disso, o conhecimento da coloração de fundo do dimer biotinilado é crítico, pois qualquer porcentagem menor do que essa mancha nos tubos manchados de cognato deve ser considerado um resultado negativo.
Após sete dias de enriquecimento e expansão, entre duas vezes 10 a 10 e duas vezes 10 para o quinto antígeno específico e cinco a 50% células CD8+T podem ser esperadas de uma população original cinco vezes 10 para a sexta população de partida de células CD8+T endógenas. A mesma metodologia pode ser usada para isolar e estimular células CD8+T específicas de antígenos humanos com aumentos semelhantes em percentuais e número de células CD8+T específicas de antígeno observadas após apenas uma semana de expansão após o enriquecimento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de realizar as verificações de qualidade do reagente apropriadas conforme descrito.
Após este procedimento, outros métodos como citometria de fluxo para coloração de citocinas intracelulares ou expressão de proteína superficial podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a funcionalidade ou fenótipo das células. Essa técnica abre caminho para pesquisadores do campo básico de imunologia explorarem a amplitude, profundidade e dinâmica das respostas específicas do antígeno em outros campos biomédicos, como câncer, doenças infecciosas ou pesquisa de autoimunidade.
