Así que la principal ventaja de nuestra novedosa técnica, la denominamos E plus E, que significa enriquecimiento más expansión, es que podemos enriquecer y expandir estas células, células raras específicas de antígenos, simultáneamente. Esto nos permite desarrollar un número suficiente de células que vamos a poder utilizar para investigar su papel en diferentes entornos y en diferentes entornos clínicos o incluso nos permite desarrollar ahora un gran número de células que podemos utilizar para la inmunoterapia de una manera que antes no podíamos. El método que hemos desarrollado, este E plus E, puede ayudar a responder preguntas clave en inmunología básica sobre la presencia de neoepitopes.
¿Qué son los neoepitopes? Esos son los epítopos personalizados que sabemos que ahora son muy importantes en términos de inmunoterapia contra el cáncer y también dinámicas específicas de antígenos y cómo estos factores afectan a los estados de la enfermedad y para la terapia celular eficaz. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la inmunoterapia, ya que la célula que presenta antígenos artificiales de nanopartículas podría ser un producto listo para usar que se adapta fácilmente a las respuestas inmunitarias individuales del paciente.
Para generar células que presentan antígenos artificiales de nanopartículas, resuspendir las partículas liofilizadas en un mililitro de tampón de resuspensión y vórtice vigorosamente la suspensión durante al menos 15 minutos hasta que no se alcancen agregados visibles. Las partículas no con suficiente vórtice y resuspendidas antes de la reacción con proteína darán como resultado partículas agregadas más grandes que no pueden ser disociadas. Coloque las partículas magnéticas en un soporte magnético para quitar el sobrenadante y resuspendélas con 0,5 mililitros de tampón de resuspensión fresca.
Transfiera la suspensión de partículas a un vial de centelleo de vidrio para el vórtice hasta que no haya agregados visibles, y agregue 0,1 miligramos de señales estimulantes totales por un miligramo de partículas resuspendidas. Después del vórtice, permita que la suspensión reaccione durante 2,5 horas a temperatura ambiente con la mezcla en un rotador, seguido de la adición de 0,1 mililitros de tampón de enfriamiento para una incubación adicional de 30 minutos a temperatura ambiente con mezcla. Al final de la segunda reacción, coloque el vial de centelleo en el soporte magnético y lave las partículas en un mililitro de tampón de resuspensión cuatro veces, eliminando el tampón cuando se vuelva claro después de cada lavado y sustituyéndolo por un tampón de resuspensión fresco para el lavado posterior en el imán.
Después del último lavado, aspirar la solución y eliminar las partículas del soporte magnético, luego almacenar las partículas en un mililitro de tampón de resuspensión fresca a cuatro grados Celsius durante un máximo de seis meses. Para aislar células CD8+T específicas de antígenos, macera los bazos y ganglios linfáticos de ratones negros 6J de tipo salvaje C57 a través de un colador celular estéril de 70 micrómetros con enjuagues frecuentes de PBS y utilice un kit de aislamiento de células CD8+T sin contacto de acuerdo con las instrucciones del fabricante para eliminar las células no CD8+T. Después de contar, recoger las células aisladas CD8+T por centrifugación y resuspend el pellet en 100 microlitros de PBS complementados con 0.5%búrica sérica bovina y EDTA de dos milímetros, luego incubar las células con las células que presentan antígenos artificiales de nanopartículas de tal manera que hay una vez 10 a la 11a MHC-ig cargada con péptidos por una vez 10 a la sexta células AISLADAs CD8+T en un estéril , tubo de fondo redondo de poliestireno de cinco mililitros durante una hora a cuatro grados centígrados con mezcla continua.
Al final de la incubación, lave la suspensión de la célula de nanopartículas tres veces en el soporte magnético como se ha demostrado, resusppendiendo las células que presentan antígenos artificiales y las células CD8+T enriquecidas en 500 microlitros de medio fresco, suplementado con factor de crecimiento de células 1%T después del último lavado. Para la máxima recuperación celular, es fundamental dejar las partículas y células en la columna magnética durante al menos dos minutos y aspirar el búfer cuidadosamente sin interrumpir las partículas y células sujetas al campo magnético. Después de contar, siembra 2,5 veces 10 a la quinta células CD8+T enriquecidas y mezcla de partículas magnéticas por 160 microlitros de medio suplementado más 1%TCGF en una placa con fondo en U de 96 pozos.
En el tercer día, alimentar las células con 80 microlitros de medio suplementado con factor de crecimiento de células 2%T por pozo y devolver la placa a la incubadora de cultivo celular durante cuatro días más. En el séptimo día, cosecha las células estimuladas en un tubo de cinco mililitros de fondo redondo para contar y recoger las células por centrifugación. Resuspender el pellet en 0,5 mililitros de PBS complementados con 0,05%azida sódica y 2%suero bovino fetal para conteo y alícuota cinco veces 10 a la cuarta a cinco veces 10 a las quintas células en nuevos tubos de fondo redondo de cinco mililitros para la tinción específica de antígenos.
Etiquetar los tubos apropiados con MHC-ig biotinilado y CD8a antiratón durante una hora a cuatro grados centígrados, seguido de un lavado de centrífugas en PBS fresco para eliminar cualquier exceso de inmunoglobulina biotinilada, luego manchar las muestras con un anticuerpo secundario conjugado con estreptavidina adecuada y una cepa de célula muerta fijable adecuada durante 15 minutos a cuatro grados Celsius y leer las células en un citómetro de flujo para determinar la especificidad y el número de las células CD8+T específicas del antígeno de acuerdo con los protocolos estándar. Aquí se logró una conjugación proteica exitosa utilizando tres métodos diferentes de unión de proteínas a las partículas. Si la densidad del ligando aAPC es demasiado baja, no habrá una estimulación efectiva de las células CD8+T específicas del antígeno.
El control de calidad del dimer biotinilado se puede completar en células transgénicas CD8+T para verificar la tinción. Por ejemplo, estos resultados representativos muestran una tinción positiva con células CD8+T específicas de gp100 con celdas b6 CD8+T no específicas de antígenos como control de fondo. Además, el conocimiento de la tinción de fondo del dimer biotinilado es crítico, ya que cualquier porcentaje inferior a esta tinción en los tubos manchados de cognado debe considerarse un resultado negativo.
Después de siete días de enriquecimiento y expansión, entre dos veces 10 a la cuarta y dos veces 10 a la quinta antígeno específica y cinco a 50%CD8+T células se pueden esperar de una original cinco veces 10 a la sexta población inicial de células ENDógenas CD8 +T. La misma metodología se puede utilizar para aislar y estimular células CD8+T específicas de antígenos humanos con aumentos similares en porcentajes y números de células CD8+T específicas del antígeno observadas después de sólo una semana de expansión después del enriquecimiento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar las comprobaciones de calidad de reactivos adecuadas como se describe.
Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la citometría de flujo para la tinción intracelular de citoquinas o la expresión de proteínas superficiales para responder preguntas adicionales sobre la funcionalidad o el fenotipo de las células. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la inmunología básica exploren la amplitud, profundidad y dinámica de las respuestas específicas del antígeno en otros campos biomédicos como el cáncer, las enfermedades infecciosas o la investigación autoinmunitaria.
