وبالتالي فإن الميزة الرئيسية لتقنيتنا الجديدة، يطلق عليها E plus E، التي ترمز إلى الإثراء بالإضافة إلى التوسع، هي أنه يمكننا إثراء وتوسيع هذه الخلايا، خلايا مستضدية نادرة محددة، في وقت واحد. وهذا يسمح لنا بتطوير عدد كاف من الخلايا التي نحن في طريقنا إلى أن تكون قادرة على استخدام للتحقيق دورها في بيئات مختلفة وفي بيئات سريرية مختلفة أو حتى يسمح لنا لتطوير الآن عدد كبير من الخلايا التي يمكننا الاستفادة من العلاج المناعي بطريقة أننا لم نتمكن من قبل. الطريقة التي قمنا بتطويرها، هذا E زائد E، يمكن أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم المناعة الأساسية حول وجود neoepitopes.
ما هي النيوبيات؟ تلك هي epitopes الشخصية التي نعرفها هي الآن مهمة جدا من حيث العلاج المناعي للسرطان وأيضا ديناميات مستضد معين وكيف تؤثر هذه العوامل على حالات المرض والعلاج الخلوي الفعال. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج المناعي ، حيث يمكن أن تكون الخلية الاصطناعية لتقديم المستضدات النانوية منتجًا جاهزًا مصممًا بسهولة لاستجابات المناعة الفردية للمرضى.
لتوليد الخلايا الاصطناعية التي تقدم مستضد نانو، resuspend الجسيمات الميوفيلي في ملليلتر واحد من عازلة resuspension ودوامة بقوة تعليق لمدة 15 دقيقة على الأقل حتى لا تكون المجاميع مرئية. الجسيمات لا دوامة بما فيه الكفاية و resuspended قبل التفاعل مع البروتين سيؤدي إلى أكبر الجسيمات المجمعة التي لا يمكن فصلها. ضع الجسيمات المغناطيسية على حامل مغناطيسي لإزالة المسرع و resuspend لهم مع 0.5 ملليلتر من عازلة resuspension الطازجة.
نقل تعليق الجسيمات إلى قارورة التكتل الزجاجي للدوامة حتى لا تكون المجاميع مرئية، وإضافة 0.1 ملليغرام من مجموع الإشارات المحفزة لكل ملليغرام واحد من الجسيمات resuspended. بعد دوامة، والسماح للتعليق للرد لمدة 2.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع خلط في دوار، تليها إضافة 0.1 ملليلتر من عازلة التبريد لاحتضان إضافية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الاختلاط. في نهاية التفاعل الثاني، ضع قارورة التلألؤ على الحامل المغناطيسي واغسل الجسيمات في ملليلتر واحد من عازلة إعادة الراسبوسين أربع مرات، وإزالة العازلة عندما يتحول واضح بعد كل غسل واستبداله مع عازلة إعادة التدهور الطازجة لغسل لاحقة على المغناطيس.
بعد الغسيل الأخير ، استلهم المحلل وأزيل الجسيمات من الحامل المغناطيسي ، ثم قم بتخزين الجسيمات في ملليلتر واحد من عازلة إعادة التدهور الطازجة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر. لعزل الخلايا CD8 + T الخاصة المستضد، اضمح الطحال والعقد الليمفاوية من النوع البري C57 الفئران السوداء 6J من خلال مصفاة خلية معقمة، 70 ميكرومتر مع شطف برنامج تلفزيوني متكررة واستخدام طقم عزل الخلايا CD8 + T بدون اتصال وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للقضاء على الخلايا غير CD8 +T. بعد العد، وجمع معزولة CD8 + T الخلايا عن طريق الطرد المركزي و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تكمل مع 0.5٪ بوفين مصل الألبومين واثنين من ملليمولار EDTA، ثم احتضان الخلايا مع الخلايا الاصطناعية مستضد تقديم النانو بحيث أن هناك مرة واحدة 10 إلى 11th الببتيد محملة MHC-IG في مرة واحدة 10 إلى الخلايا CD8 + T المعزولة السادسة في العقيمة ، خمسة ملليلتر البوليسترين أنبوب مستدير القاع لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية مع خلط مستمر.
في نهاية الحضانة، وغسل تعليق خلية الجسيمات النانوية ثلاث مرات على موقف مغناطيسي كما هو موضح، resuspending الخلايا الاصطناعية عرض مستضد والخلايا CD8 + T المخصب في 500 ميكرولترات من الطازجة، تكمل المتوسطة مع 1٪ T عامل نمو الخلايا بعد الغسيل الماضي. للحصول على أقصى قدر من استعادة الخلايا، من المهم ترك الجسيمات والخلايا على العمود المغناطيسي لمدة دقيقتين على الأقل، والطامح المخزن بعناية دون تعطيل الجسيمات والخلايا الخاضعة للمجال المغناطيسي. بعد العد، بذور 2.5 مرات 10 إلى الخامس المخصب CD8 + T الخلايا والجسيمات المغناطيسية خليط لكل 160 ميكرولترات من المتوسط المكمل بالإضافة إلى 1٪ TCGF في 96-جيدا يو القاع لوحة.
في اليوم الثالث، تغذية الخلايا مع 80 ميكرولترات من المتوسطة المكملة مع عامل نمو خلية T 2٪ في بئر وعودة لوحة إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة أربعة أيام أخرى. في اليوم السابع، حصاد الخلايا المحفزة في أنبوب دائري القاع خمسة ملليلتر للعد وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. Resuspend بيليه في 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني تكملها 0.05٪ أزيديد الصوديوم و 2٪ مصل الأبقار الجنينية للعد و aliquot خمس مرات 10 إلى الرابعة إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الخامسة في أنابيب جديدة مستديرة القاع خمسة ملليلتر لتلطيخ مستضد معين.
تسمية الأنابيب المناسبة مع biotinylated MHC-IG ومكافحة الماوس CD8a لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية، تليها غسل الطرد المركزي في برنامج تلفزيوني جديد لإزالة أي الغلوبولين المناعي الحيوي الزائد، ثم وصمة عار العينات مع جسم مضاد ثانوي مناسب streptavidin-مترافق و سلالة الخلايا الميتة حية ميتة مناسبة قابلة للإصلاح لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية وقراءة الخلايا على مقياس تدفق لتحديد خصوصية وعدد من الخلايا CD8 + T المضادة الخاصة مستضد وفقا للبروتوكولات القياسية. هنا تم تحقيق اقتران البروتين الناجح باستخدام ثلاث طرق مختلفة من البروتين المرفق بالجسيمات. إذا كانت كثافة الرابطة AAPC منخفضة جدا, لن يكون هناك تحفيز فعال من الخلايا CD8 + T المضادة الخاصة.
ويمكن استكمال مراقبة الجودة من خافض biotinylated على الخلايا CD8 + T المعدلة وراثيا للتحقق من تلطيخ. على سبيل المثال، تظهر هذه النتائج التمثيلية تلطيخ إيجابي مع خلايا CD8 + T محددة gp100 مع خلايا B6 CD8 +T غير خاصة مستضدية كتحكم في الخلفية. وعلاوة على ذلك، فإن معرفة الخلفية تلطيخ من ديمر biotinylated أمر بالغ الأهمية، كما ينبغي اعتبار أي نسبة مئوية أقل من هذا التلطخ في الأنابيب الملطخة cognate نتيجة سلبية.
بعد سبعة أيام من التخصيب والتوسع، بين مرتين 10 إلى الرابعة واثنين من 10 إلى الخامس مستضد محددة وخمسة إلى 50٪ CD8 + الخلايا التائية يمكن أن يتوقع من الأصلي خمس مرات 10 إلى السادسة الذاتية CD8 + T خلية بدء. ويمكن استخدام نفس المنهجية لعزل وتحفيز خلايا CD8 +T الخاصة بمستضد بشري مع زيادات مماثلة في النسب المئوية وأعداد خلايا CD8 +T الخاصة بالمستضدات التي لوحظت بعد أسبوع واحد فقط من التوسع بعد التخصيب. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر إجراء فحوصات جودة الكاشف المناسبة كما هو موضح.
بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل عملية استئصال الخلايا المتدفقة لتلطيخ السيتوكين داخل الخلايا أو تعبير البروتين السطحي للإجابة على أسئلة إضافية حول وظيفة الخلايا أو النمط الظاهري للخلايا. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة الأساسي لاستكشاف اتساع وعمق وديناميات الاستجابات الخاصة بالمستضد في مجالات طبية حيوية أخرى مثل السرطان أو الأمراض المعدية أو أبحاث المناعة الذاتية.
