Solunum sinsi siniyel virüsüne karşı önemli bir koruma göstergesi olarak, rsv nötralize antikorları ölçmek için doğru ve yüksek iş elde etme yöntemi için bir ihtiyaç vardır. Bu yöntem referans antiserum un %10'dan az olması için yapılan tahsoz varyasyonları ile son derece tekrarlanabilir biz bu tahkikatın dünya çapında birçok laboratuvarda nispeten düşük maliyetle kolayca kurulabileceğine inanıyoruz. Burada RSV alt grubu A üzerinde test edilmiş ve ayrıca RSV alt grubu B ve farklı numune tipleri için uyarlanabilen görüntüleme tabanlı mikro nötralizasyon testini açıklıyoruz.
Prosedürü gösteren Reuben Tse, MCRI araştırma ekibinin bir üyesi olacaktır. İlk gün tabakları tohumlamak için, ilk olarak DMEM medyasında A549 hücrelerini yeniden askıya alın, %10 FCS ve 1, 000 adet Penisilin-Streptomisin karışımı 400 konsantrasyonda, mililitre başına 000 hücre. Sonra tohum 96-iyi düz-alt steril plakalar ile 40, 000 A459 hücreleri kuyu başına 100 mikrolitre yoğunluğu.
Plakayı bir gecede %5 karbondioksit ortamında 37 derecede kuluçkaya yatırın. İkinci gün serum seyreltme hazırlamak için, ilk oda sıcaklığında insan RSV referans serum ve serum test örnekleri çözültün. Daha sonra 56 santigrat derecede 30 dakika ısıtArak aktive edin.
Daha sonra, referans serumun 1 ila 100 seyreltilmesinin 110 mikrolitresinden fazlasını, referans serumun 1,5 mikrolitresini FCS içermeyen DMEM ortamı ile Penisilin-Streptomisin karışımıyla 150 mikrolitrelik son hacmikarıştırın. Pipet 110 mikrolitre bu seyreltme 96-iyi U-alt steril plaka iyi A12 içine. Plaka aşağı seri bir ila iki seyreltme yapmak için, ilk wells B12 h12 için Penisilin-Streptomisin karışımı ile FCS içermeyen DMEM medya 55 mikrolitre ekleyin.
Sonra yeni bir ipucu ile iyi A12 iyi B12 55 mikrolitre aktarın. Pipet yukarı ve aşağı beş kez çözelti karıştırmak için, ve iyi H12 ulaşana kadar devam edin. Deh12 çözeltisinin fazla 55 mikrolitre kapalı Pipet.
Daha sonra, serum test örneklerinden 1 ila 100 seyreltme hazırlayın ve 96 kuyulu steril plakanın A1'den A9'a ve E1'den E9'a karşılık gelen kuyulara her seyreltmenin 110 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra penisilin-Streptomisin karışımı ile FCS içermeyen DMEM medya 55 mikrolitre ekleyin sütunlar halinde kuyular bir ile dokuz arasında. Daha önce açıklandığı gibi A satırD ve satır E'den H satırına seri bir ila iki seyreltme yapın.
10 ve 11 sütunlarında bulunan kuyulara Penisilin-Streptomisin karışımı ile 55 mikrolitre FCS içermeyen DMEM ortamı ekleyin. Virüs stokhazırlamak için, ilk hızla çözülmek için 37 derece santigrat su banyosu rsv dondurulmuş bir şişe koymak, sonra buz üzerinde şişe yerleştirin. Daha sonra, 100 kuyu için 55 mililitre toplam hacmi yapmak için iyi başına yaklaşık 200 PFU penisilin-Streptomisin karışımı içeren DMEM medya ya da virüs ekleyin.
Virüs serum karışımı hazırlamak için, ilk sütun 1 ile dokuz ve sütun 10 ve 11 H ile E satır kuyuları tüm kuyulara seyreltilmiş virüs 55 mikrolitre ekleyin. Daha sonra Penisilin-Streptomisin karışımı ile 55 mikrolitre FCS-Streptomycin karışımı 10 ve 11 sütunların D ile D tüm kuyuları ekleyin ve bir saat boyunca% 5 karbondioksit ortamında 37 derece santigrat plaka kuluçka. A549 hücrelerinin RSV ile aşılanmasından önce, A549 hücre monokatmanlarının %80 konfluent olduğunu doğrulamak için hücre plakasını ışık mikroskobu altında inceleyin.
Daha sonra ortamı atmak için tabağı hafifçe ters çevirin ve tabağı steril emici bir kağıt havluüzerinde hafifçe lekelayın. Her biri sonra, filtrelenmiş steril PBS ile yıkayın. Sonraki el yazması sağlanan plaka şablonuna göre A549 hücre plakası üzerinde ilgili kuyulara virüs serum karışımı nın kuyu başına 100 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca% 5 karbondioksit% 5 santigrat derece plaka kuluçka.
Kuluçka sonunda, kuyu başına 90 mikrolitre kaldırmak için bir pipet kullanın ve Penisilin-Streptomisin karışımında 1XM199, %1,5 CMC ve %2 FCS içeren 100 mikrolitre ortam ekleyin. Plakayı 37 derecede %5 karbondioksitle üç gün boyunca kuluçkaya yatırın. Bir bir teşbik plakasını düzeltmek ve geliştirmek için, ilk olarak RsV'ye bulaşmış A549 hücre plakasını ters çevirin ve M199, CMC, %2 FCS ve Penisilin-Streptomisin karışımı içeren ortamı atın.
Sonra yavaş yavaş her kuyuya Fiksasyon Tampon 200 mikrolitre ekleyin. Plakayı eksi 20 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra sabitleme tampon atın ve hafifçe emici bir kağıt havlu üzerinde leke.
Tabağı yüz üstü 10 dakika kurumaya bırakın. Daha sonra 05 polisorbat 20 içeren filtrelenmiş PBS tampon ile% 5 süt engelleme çözeltisi olun. Her kuyuya 200 mikrolitre blokçözeltisi ekleyin ve tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda yavaşça çözelti atmak ve emici bir kağıt havlu üzerinde leke plaka ters. Birincil antikor yapmak için, bloklama çözeltisi 1 ila 500 keçi XRSV antikor seyreltin. Her kuyuya 50 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede plaka kuluçka.
Filtrelenmiş PBS-polisorbat ile tabağı üç kez yıkayın. Sonra, bloklama çözeltisi 1-5, 000 Alexa Fluor eşek anti-keçi immünglobulin G seyrelterek ikincil antikor olun. Her kuyuya 50 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Filtrelenmiş PBS-polisorbat ile plakayı beş kez yıkayın. Otomatik spot okuyucuile plakları saymak için, ilk olarak FITC kanalındaki sayım ayarlarını girerek enstrümanla işbirliği yapmak için kullanılmayan 96 kuyulu bir kültür plakası kullanın. Sonra hücre plakasını oku, folyoya sar ve dört santigrat derecede saklayın.
Daha sonra, sanatsal plaklar veya bozulmuş hücre monolayers için kuyuların görüntülerini kontrol edin ve bozulmuş hücre monolayers ile kuyuları hariç. No-serum kontrol kuyularının ortalama plak sayısı hesaplandı ve virüs aktivitesinin %50 inhibisyonuna yol açacak %50 nötralizasyon kesintisini belirlemek için kullanıldı. Karşılıklı serum seyreltme x ekseni ve iki nokta arasında çizilen bir çizgiden yarı günlük grafiğin y ekseninde plak sayısı çizildi.
Test serumu örneklerinin %50 nötralizasyon titreleri kırmızı, serumsuz kontrol kuyularının %50 değerinin hemen üzerinde veya altında sayımlar yapılan serum seyreltmeleri saptandı. Gambiya ve Melbourne sağlıklı gönüllüler iki farklı yetişkin kohortlar RSVAPRN tahliller Gambiya yetişkin Melbourne yetişkinlere göre daha düşük ortalama NAB titre sahip sonuçlandı. Gösterilen insan RSV-referans serum varyasyon katsayısı ile çok düşük değişkenlik gösterir 6.82%Bu geliştirilmiş yüksek iş lenme RSV plak azaltma nötralizasyon tahlil kolayca birçok laboratuvarda uygulanabilir, ve RSV nötralize antikor tahlilleri için WHO uluslararası uyum çabasını destekleyecek.
Bu gelecekte yeni RSV aşısı adaylarının değerlendirilmesi için kritik olacaktır.
