Bu protokol, ceramal plazmada kolesterol reflüsünün kolesterolü sonlandırılması için hücre bazlı yöntemimizdir. Özellikle gösterimlerde. Bu kardiyovasküler risk tanısı için uygulanabilir, ve tanımlamak veya kolesterol düşük bakım değerlendirmek için.
Bu teknik, benzer kalite düzeyleri ile sonuçlar sağlayarak yayılan malzemelerin taşınması ile risk ve yükleri önler, Kolesterol reflü olanlar ait böylece ilişkilendirmek için bildirilmiştir, plazma veya ceramal kolesterol reflü kabul karşılaştırılabilir, bizim referans kontrolü ve bu yöntemden muzdarip riskini sağlayabilir hücre hatları da uygulanacaktır , diğer insan hücre hatları ve hatta birincil makro aşamaları gibi. Makro fazlar veya ve insan kaynaklı sprey düğmesi kök hücreleri. Bu prosedürü başlatmak için, iki mikromolar son konsantrasyonu ile bir stok çözeltisi elde etmek için saf etanol NPD kolesterol eritmek.
Beş mikromolar son konsantrasyonulaşmak için AR 10 orta NBD kolesterol stokunun seyreltilmiş 25 mikrolitre. Kültür thp-1 hücreleri bizim 10 orta 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile. Her üç günde bir hücre yoğunluğunu mililitre başına 300.000 hücreye ayarlayın.
Sonra düz bir açık alt ile 96-iyi plaka elde edin. Daha iyi homojenizasyon için, 15 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre thp-1 hücresi hazırlayın ve 200 mikrolitre PMA stoku ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 200, kuyu başına 000 hücreleri plaka kuyuları içine karışımın 100 mikrolitre tohum.
Thp-1 hücrelerini DM thp-1 hücrelerine ayırmak için 48 ila 72 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. İlk seyreltik glisin 10% PBS steril su ile, pH 7.4 de 200 mikromolar konsantrasyonu için. %20 peg çözeltisi hazırlamak için 10 gram peg 8000'e 40 mililitre seyreltilmiş glisin ekleyin ve homojenize etmek için şiddetle karıştırın.
Daha sonra 1,5 ml'lik bir tüpteki her serum veya plazma örneğine numunenin 10 parça başına %20'si dört parça uygulayın. Karışımı 25 dakika buzda bekletin. Peg apolipoprotein B santrifüj 13000 kez G çöktü ve 15 dakika boyunca dört derece santigrat.
Çökelti atın ve yeni bir tüp için supernatant aktarın. Farklılaştırılmış thp-1 hücrelerini içeren plakayı alın. Kültür ortamını çıkarın ve atın ve hücreleri 1X PBS ile iki kez yıkayın.
Her kuyuya AR-10 orta 5 mikromolar MVD kolesterol 100 mikrolitre ekleyin. Bir gecede %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat. Ertesi gün atın, orta atın.
Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve sonra 100 mikrolitre ABDS ekleyin veya saflaştırılmış lipid alıcı rpmi seyreltilmiş 1630 orta her bir kuyuya istenilen konsantrasyona. Metin protokolünde belirtildiği gibi, kolesterol kabul edenleri içermeyen negatif bir kontrol ekleyin ve 4-6 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Bu arada, metinde belirtildiği gibi hücre lisis çözüm bir 200 mililitre stok hazırlayın.
Bu çözeltiyi etanol ile karıştırın, bire bir hacimsel oranda da lysis çözeltisi elde edin. Medya ve BD kolesterol tespiti için, opak düz alt ile yeni bir beyaz 96-well plaka toplanan plakalardan hücre orta kaldırın. Yeni plakada bire bir oranı elde etmek için her orta numunenin 100 mikrolitresine 100 mikrolitre saf etanol ekleyin.
Bir illuminometre kullanarak, floresan yoğunluğunu 463 nanometre uyarma ve 536 nanometre emisyon ölçün. Hücre içi NBD kolesterol tespiti için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Her kuyuya 100 mikrolitre lysis çözeltisi ekleyin ve 25 dakika sallayarak oda sıcaklığında kuluçkaya yatın.
Bundan sonra, yazılımdaki duyarlılık parametresini 50'ye ayarlarken floresan yoğunluğunu ölçün. Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi kolesterol efflux son ölçüsünde kolesterol efflux oranını belirlemek. Saf etanol nbd kolesterol seyreltme sulu çözeltiyüksek içerik, yoğunluğunu düşürür iken en yüksek floresan yoğunluğu değerleri üretir.
Bu, floresan salınımının bu molekülün içerdiği ortama son derece bağımlı olduğunu göstermektedir. Bire bir oranında ortam ve etanol karışımı kullanılırken, floresan yoğunluğu orantılı olarak artış gibi görünüyor, kolesterol analog bir konsantrasyon ile, prob bu koşullar altında uygun davrandığını düşündürmektedir. Yüklü hücreleri kolesterol kabul edenlerle kuluçkaya yatırmak için gereken süreyi belirlemek için hücre ortamı farklı zaman noktalarında hasat edilir.
Kolesterol efflux doğrusal olarak sıfırdan altı saate kadar gelişti ve maksimum sinyal ABDS hücrelere eklendikten altı saat sonra alındı. Doygunluk eşiği ve dinamik aralık, medya içeren HDL'nin farklı yüzdelerinde kolesterol efflux'ü ölçerek test edilir. Yüksek verim varlığında, efflux doğrusal olarak %1'den %7'ye yükselir ve %7'den yüksek konsantrasyonlarda kolesterol efflux kapasitesinin zirvesine ulaşır ve fluroescent'in yoğunluğu ABDS yüzdesi ile ters bir ilişkide azalır.
Floresan tabanlı yöntemin performansı daha sonra standart radyo etiketli teknik ile karşılaştırılarak değerlendirilir. Her iki teknik de abds farklı konsantrasyonlarda kullanırken son derece ilişkilidir. Açıklanan yöntem, kolesterol efflux değerleri içinde kabul eden konsantrasyonların %5 ile %15 arasında artmasına duyarlıdır Selülarizerin agrega içermediğinden emin olmak önemlidir.
Kritik nokta, homojen ve optimum ağırlıkta floresan ölçmek için, bir agrega etanol içeren bir ortam sınıflamaktır. Bu işlemden sonra, adı teknik kolesterol ölçülebilir, ve kolesterol efflux yolu ilaçların etkisi belirlenebilir. Ayrıca okul sonunda kardiyovasküler risk asses bir tanı olarak kullanılabilir.
Bu yöntemin radyoaktif standart yöntemden çok daha kolay ve güvenli olduğuna inanıyoruz. Ancak yine de hücre bağımlısıdır. Etanol'ün yanıcı olduğunu ve buna göre depolanıp ele alınması gerektiğini lütfen unutmayın.
