Tek moleküllü FRET, ribozomal protein biyosentez işlemi için doğru ölçek olan nanometre mesafelerinde gerçekleşen dinamikleri yakalayabilir. Ribozom, özünde inhomogeneous olan allosterik olarak birden fazla faktör ve bileşeni koordine ederek çalışır. Tek moleküllü yöntem, bu inhomogeneous ortalama etki ile sınırlı kalmadan her ribozom izleyebilir.
Bu yöntem, antibiyotiklerin ilaca dirençli bakteriyel enfeksiyonlara yönelik yeni ilaçlar geliştirmek için ribozom fonksiyonunu nasıl inhibe edeceğini ortaya koymaktadır. Başlangıç EFTU, NOG ve PAG karışımını iki dakika boyunca 37 santigrat derecede bir ila iki oranında karıştırarak PRE'yi hazırlayarak başlayın. Kuluçkadan sonra, PRE'yi 100.000 kez gece boyunca 1,1 molar sakkaroz yastığı ultrasantrifüjü kullanarak arındırın G.Başlangıç EFTU, WG ve PHE karışımını 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir ila iki oranında karıştırarak POST'u hazırlayın.
Kuluçkadan sonra, POST'u 1.1 molar sakkaroz minderi ultrasantrifüjasyonu kullanarak bir gecede 100.000 kez saflaştırın G.Bir milimetre çapında altı çift delik ve 1.5 mikroskop cam kapakları içeren mikroskop cam slaytları temizleyin. Temiz slaytları ve kapakları 300 santigrat derecede üç saat pişirin, ardından kapak kapağını aminosaline ile kaplayın. Temiz bir laminar davlumbazda, yüzeye bir kapak düz döşeyin.
Üst kenara 60 mikrolitre PEG çözeltisini dikkatlice bırakın, ardından üzerine başka bir kapak ucu yerleştirin, kılcal damar etkisinin çözeltiyi aralarında yaymasına izin vererek kabarcık oluşmamasını sağlayın. İki çift kapak kılıfı için bu adımları yineleyin. Bu kapakları su dolu boş bir uç kutusunda saklayın ve karanlıkta üç saat boyunca kuluçkaya yatırın.
Üç saat sonra, kapakları ayırın, art arda üç potada suyla durulayın ve kuru bir azot akışı ile arındırın. Cam kaydıraklardaki deliklerden sıkıca oturana kadar keskin pipet uçlarını çekin. Keskin uçları cam yüzeyle tamamen düz olana kadar kazıyın, ardından üzerinde kanal deseni olan çift yüzlü bir bant kesin.
Düz taraftaki cam slaytlara yapıştırın. Kaplamalı kapak sapını çift yüzlü bant üzerine yapıştırın ve kaplamalı tarafın içe doğru dönük olduğundan emin olarak numune odasının sıkı bir mührünü yapmak için üzerine bastırın. Bilgisayarı ve mikroskop anahtarını açın.
Lazer kontrol arayüzünü başlatın ve lazeri açın. Lazeri ısıtmak için lazer kontrol kutusundaki etkinleştir düğmesine basın. Kameraları açın ve mikroskopla ilişkili yazılım programını başlatın.
Üst deklanşörü tıklatın ve lambayı tıklayın. Tam10'u bir mililitre TAM10 arabelleğine %5 Tween-20'lik 10 mikrolitre ekleyerek ARA TAMPONla hazırlayın. Küçük bir mikrosantrifüj tüpünde üç miligram glikoz oksidaz tartarak deoksi çözeltisini hazırlayın ve içine 45 mikrolitre katalaz ekleyin.
Katıyı çözmek için tüpü nazikçe vorteks edin. Bir mikrosantrifüjde 20.000 G'de bir dakika dön ve üst taraftakiyi al. Metin el yazmasındaki talimatları izleyerek% 30 glikoz çözeltisi, 200 milimoler Trolox çözeltisi ve mililitre streptavidin çözeltisi başına 0,5 miligram hazırlayın.
Çim hedefine bir damla görüntüleme yağı ekleyin. Örnek odaları hedefe koyun. Odayı 10 mikrolitre streptavidin çözeltisi ile doldurun ve bir dakika bekleyin.
Hazneyi 30 mikrolitre TAM10 ile Ara tamponu ile yıkayın ve katlanmış bir filtre kağıdı ile çalıştırılan çözeltiyi toplayın. Yıkadıktan sonra bir dakika bekleyin. Ribozom komplekslerini PRE veya POST'u TAM10 ile Tween tamponu ile 10-15 nanomolar konsantrasyona seyreltin.
Ribozom örneğinin 20 mikrolitresini kanala yükleyin ve iki dakika bekleyin. Deoksiglucose ve Trolox çözeltisinin her biri 50 mikrolitre TAM10 tampon ve 0,5 mikrolitre kullanarak görüntüleme tamponu yapın. İyice karıştırın.
Odayı 30 mililitre görüntüleme tamponu ile yıkayın. Kamerayı görüntü almak için ayarlayın. Üst deklanşörü tıklatın ve lambayı kapatın.
Kamera alımını başlatın ve görüntüleri iki ayrı kamerayı ve kaplamayı temsil eden üç pencereye yayın. Edinme menüsünün altında yakalama zaman çizipse'yi seçin ve ardından otomatik olarak yakalama'ya tıklayın. Uygun dosya adını, dosya yolunu ve döngü sayısını ayarlayın ve şimdi çalıştır'ı tıklatın.
Görüntü alımı tamamlandıktan sonra açılır pencereyi kapatın ve sonra alınan ND dosyasını açın. Yatırım getirisi, basit yatırım getirisi editörüne tıklayın ve seçenek çemberini seçin. Görüntüdeki yatırım getirisini seçin ve tamamlandığında bitiş'e tıklayın.
Verileri çizim veya elektronik tablo olarak göstermek için ölçüme, zaman ölçümüne tıklayın. Dışa aktarma parametrelerini ayarlamak için dışa aktarma sekmesini açın, sonra yoğunlukları kaydetmek için dışa aktar'ı tıklatın. Son olarak, uygun bir uygulama kullanılarak dışa aktarılan dosyayı açın.
L27 etiketleme kalıntısından A-site veya P-site tRNA'ya olan mesafe sırasıyla 61 veya 52 angstromdur ve 0,47 ve 0,65 FRET verimliliğine karşılık gelendir. Donör ve alıcı kanallardan floresan yoğunlukları alındı ve zaman çizilerek çizildi. Donör ağartma işleminden sonra, her iki iz de taban çizgisine yaklaştı, çünkü doğrudan alıcıda herhangi bir ekscitasyon gerçekleşemedi.
Kabul eden ağartmadan sonra, daha az reaksiyon yolu uyarılma enerjisini dağıttığı için donör yoğunluğu arttı. Bireysel ribozomlar, L27'de mesafe dalgalanmalarına neden olan tRNA'ların sallanan hareketi nedeniyle farklı dalgalanmalar sergiledi. Puromycin tahlil, tahlil, ayakbaskı tahlil ve kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler tek moleküllü FRET yöntemine ücretsizdir ve protein sentezi hakkında daha fazla ayrıntı ortaya koymaktadır.
Tek moleküllü FRET geniş bir uygulamaya sahiptir, çünkü birçok biyolojik süreç nanometre aralığında ve milisaniyelik zaman ölçeklerinde gerçekleşir. Uygun boyalar uygun konumlarda etiketlenerek, diğer birçok dinamik ortaya çıkabilir.
