Yazarlar, laboratuvar uzmanlık için reçine gömme ve Bayan Stephania Mezarları Bayan Sue Connell onun uzmanlık yardımı kabul etmek istiyorum. Yazarlar, onların tavsiyelerini Profesör Frank Kandziora ve Dr Marie-Anne Polboth teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li> Dokusu,% 10 fosfat içeren kapalı bir kapta tamponlu formalin 3 içinde yer alır . Florokrom analizi fluorochromes ışığa duyarlı olarak, olması ise, minimal ışığa maruz kalma olun. </li><li> Doku hangi yönlendirme gerekli olacak kurulması. </li><li> Numune boyutuna kesin, doğru yönde, bir grup gördüm. Emin olun güvenlik önlemleri yapıştırılır. Numune sonra opak bir kap içine konur, hacmi yeterli fiksasyon elde etmek için yaklaşık on katı numune boyutu olmalıdır. Numune boyutuna bağlı olarak bir ila iki hafta olmak üzere toplam formalin kalmalıdır. Bu kontrolü doku testi ve optimizasyonu amaçlar için kullanılmasını önerdi. </li><li> Doku gömme kalıp sığar doku ve% 70 etanol içeren, kapalı bir opak kap içine yerleştirin. </li><li> Işık ve sürekli ajitasyon altında koruyucu, etanol konsantrasyonları artan doku işleyin. <ol class="lalpha"><li> % 70 etanol 1 hafta </li><li> % 80 etanol 1 hafta </li><li> % 90 etanol 1 hafta </li><li> % 100 etanol 1 hafta </li></ol></li><li> Daha sonra doku, ışık ve sabit ajitasyon altında tekrar koruyucu 1 hafta bütanol temizlenir. </li><li> Reçine ve kemik yoğunluğu yakından reçine yoğunluğu (bkz. adım 8) değiştirilebilir eşlemeli ve doğru yoğunluğu sağlamak için ilk olarak bir test örneğinin gömme tavsiye edilmelidir. Biz ışık mikroskobu ve florokrom analiz için Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) kullanın. Immünohistokimya gerekiyorsa alternatif bir reçine gibi Technovit 9100 (Heraeus Kulzer) olarak kullanılması gerekir. </li><li> Technovit 7100 hazırlık çözüm gerekirse, kit ile birlikte verilen yumuşatıcı çözüm küçük alikot ile karışık olabilir, ancak en fazla 5% hazırlık çözüm hacim; deneyimlerimiz yumuşama çözüm nadiren gereklidir. Mutlak etanol ve baz sıvı Technovit 7100 eşit parçaya 24 saat ışığa maruz kalma en aza indirmek için bir ön infiltrasyon çözüm olarak ve ajitasyon ile karıştırılır ve doku uygulanır. </li><li> Infiltrasyon çözüm sonra, 100 ml tabanı sıvı içinde çözünmüş 1 gr sertleştirici I (= 1 torba) kullanılarak yapılır. Bu ön infiltrasyon çözüm yerine sürekli ajitasyon altında 1 hafta sızmak için izin verilir. </li><li> Aşağı kesim yüzeyi yüz doku, kalıp içine yerleştirin. (Ideal olarak en az 5 milimetre) reçine için doku etrafında bir marj var olduğundan emin olun; bu blok gücü sağlar. 1 sertleştirici II ml Technovit 7100 hazırlık çözüm 15mls karıştırın ve kalıp numune etrafında dökün ve en az 5 millimietres kapağı. Kür 2 saat içinde başlayacaktır, ancak bir gecede tamamlanmış olacaktır. </li><li> Montaj Technovit 3040 (Heraeus Kulzer) kullanarak bir yedekleme blok fashioning sonra yapılır. Toz 1 kısım sıvı viskoz bir sıvı elde etmek için 2 parça bir hacim oranı 3040 Technovit karıştırın. Technovit 3040 blok blok temel üzerinde en az 2 mm bir seviyeye geri girinti içine dökün. Yaklaşık 10 dakika sonra kalıp uzak soyulmuş ve blok hazır olabilir. </li><li> Yoğunluğu ve bu nedenle metakrilat reçine kesme özellikleri, odadaki ortam nem duyarlı. Bloklar dolayısıyla desikatöre saklanmalıdır. </li><li> Zemin kesit kalınlığı 20-50 mikrometre arasında büyük bölümleri üretir. Kalın bölümlerde parlak floresan üreten (bölümüne bakınız) florokrom analizi için yararlı olur. Macrotome elmas bıçak sabitleyin. Macrotome rezervuar yağ, petrol ruhu gibi ekleyin. Güvenli ve kelepçe blok bıçak yolunuzu. İzin yeterli yağlama sağlar (Bölüm başına yaklaşık 20-30 dakika) yavaş yavaş ortaya taşlama. Ilk bölümü kesme yüzünü ortaya çıkarır ve bölümü atılmalıdır yönlendirir. </li><li> Bir sonraki bölümde, ardından bir SuperFrost Plus slayt yerleştirilir. Bu bölüm, bunun üzerinde bir sandviç torbası bir kısmını yerleştirerek ve daha sonra başka bir slayt yerde kelepçeli düz tutarak tavsiye ederiz kıvrılabilecek. Daha sonra 1 saat boyunca sıcaklık 60-80 derece arasında bir inkübatör içine yerleştirilir. Bu metakrilat yumuşatır ve düz bir şekilde slayt bölümünde uymak yardımcı olur. </li><li> Nazik bir şekilde ince kum zımpara kullanarak gerekli zemin bölümünde temizlenir ve parlatılır olabilir. </li><li> Kızak mikrotom, ince kesitler keser ışık microsocopy için en iyi bölümleri sağlar. Bu sabit bloklar kesim için gerekli sertliği, gibi bir kızak mikrotom kullanın. Alternatif olarak çalışan döner mikrotom kullanılabilir. Keskin bir paslanmaz çelik bıçak kullanın. Bu bir kullanılan diğer olarak bilenmiş olarak kullanılabilir iki ağza sahip olmak tercih edilir. Bıçak bloğu ile 45 derecelik bir açı yapmalıdır. Surface yumuşatma gerekirse engellemek için ıslak bir kağıt uygulayarak elde edilebilir. Bu kaliteli bir bölümünü elde etmek için istenilen kesme koşulları elde etmek için çeşitli bölümler sürebilir. Bu bölüm, daha sonra bir su banyosu üzerinde yüzen ve 16 olduğu gibi bir slayt yerleştirilir. </li><li> Boyama reaktifler, aşağıda Malzeme listelenmiştir. Protokoller, Bancroft 4 ve ark . Kalınlık değişimi nedeniyle test slaytlar üzerinde lekeler optimize etmek için tavsiye edilir. Raf boyama doku gerekebilir doğrudan düz bir slayt lekeleri ekleyerek böylece slayt float neden olabilir. Özdeş bir protokol ya da raf boyama histomorfometri için gerekli tutarlı boyama sonuçlar için gereklidir. <ol class="lalpha"><li> Hematoksilen ve Eosin <ol class="lroman"><li> Haematoxyilin 5-10 dakika ile Leke </li><li> Scott, musluk suyu ile yıkayın </li><li> Eozin 5 dakika ile Leke </li><li> Musluk suyunda yıkayın </li><li> Ksilen içinde Temizle </li><li> Dağı </li><li> Sonuçlar <ol><li> Osteoid = Pembe </li><li> Kalsifiye kemik = morumsu kahverengi </li><li> Çekirdekler = mavi </li></ol></li></ol></li><li> Von Kossa <ol class="lroman"><li> Gümüş nitrat çözeltisi koyun ve güçlü ışığa maruz mineralize kemik siyah olana kadar (yaklaşık 10 dakika) </li><li> Üç kez distile su ile yıkayın </li><li> 5 dakika boyunca sodyum tiyosülfat ile Tehdit </li><li> Distile su ile yıkayın </li><li> Safrinin O ile Counterstain </li><li> Ksilen içinde Temizle </li><li> Dağı </li><li> Sonuçlar <ol><li> Mineralised kemik = black </li><li> Osteoid = kırmızı / pembe </li></ol></li></ol></li><li> Masson Goldner s trikrom <ol class="lroman"><li> (% 80 etanol 90mls ve 20 dakika boyunca% 25 oranında amonyak 10mls) alkalin alkol ile yıkayın. </li><li> Suyla yıkayın </li><li> Distile su ile durulayın </li><li> 10 dakika boyunca Weigert s Hematoksilen ile Leke </li><li> Distile su ile durulayın </li><li> Ponceau-Fuchsin nihai çözüm 5 dakika ile Leke </li><li> % 1 asetik asit ile 15 saniye çalkalayın </li><li> Phosphomolybdic asit-turuncu G çözüm 5 dakika içinde Leke </li><li> % 1 asetik asit ile 15 saniye çalkalayın </li><li> 5 dakika açık yeşil ile Leke </li><li> % 1 asetik asit ile durulayın 3 değişiklik </li><li> Distile su ile durulayın </li><li> Dağı </li><li> Sonuçlar <ol><li> Mineralised kemik = yeşil </li><li> Osteoid = kırmızı / turuncu </li><li> Çekirdekler = mavi gri </li><li> Kıkırdak = mor </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Florokrom hazırlıkları: </li><li> Bunlar en az iki hafta arayla, yavaş intravenöz enjeksiyonu ile idare edilmektedir. </li><li> Dozlar <ol class="lalpha"><li> Calcein Yeşil 10 mg / kg IV </li><li> Oksitetrasiklin 50 mg / kg IV </li><li> Alizarin Complexone 30 mg / kg IV </li></ol></li><li> Calcein Yeşil hazırlanması <ol class="lalpha"><li> Calcein Yeşil Bir gram eriyene kadar 1 M NaOH ile titre edilir. </li><li> pH pH = 7,1-7,2 kadar% 1 NaOH ile ayarlanır. </li><li> Filtre ve ışıktan korumalı tutmak </li></ol></li><li> Alizarin Complexone hazırlanması <ol class="lalpha"><li> Üç gram Alizarin complexone eriyene kadar 1 M NaOH ile titre edilir. </li><li> pH pH = 7,1-7,2 kadar% 1 HCl veya NaOH ile ayarlanır. </li><li> Filtre ve ışıktan korumalı tutmak </li></ol></li><li> Oksitetrasiklin, hazırlanması <ol class="lalpha"><li> Oksitetrasiklin raftan bir anti-mikrobik ilaç olarak kullanılabilir. Herhangi bir hazırlama gerekli değildir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atlas of Functional Histology. , 164-168 (2000).</li><li>Parfitt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+histomorphometry:+standardization+of+nomenclature,+symbols,+and+units.+Report+of+the+ASBMR+Histomorphometry+Nomenclature+Committee.">Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee.</a> J Bone Miner Res. 2, 595-610 (1987).</li><li>An, Y. H., Martin, K. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of histology methods for bone and cartilage. , (2003).</li><li>Bancroft, J. D., Gamble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and Practice of Histological Techniques. , 352-360 (2008).</li></ol>

Çözücüler: <ul><li> Normal% 10 Formalin, Etanol, ksilen ve Butanol asit Tamponlu Tüm histoloji notu, kükürt ücretsiz. Grale Bilimsel Sanayi ve Ticaret Ltd. http://www.grale.com.au </li></ul> Kalıplar: <ul><li> Uzakta Peel, plastik kalıpları Grale Bilimsel </li></ul> Slaytlar: <ul><li> SuperFrost Plus Mikroskop slaytlar Lomb Bilimsel Sanayi ve Ticaret Ltd. <a href="http://www.lomb.com.au/">http://www.lomb.com.au</a> </li></ul> Reçine: <ul><li> GlycolMethacrylate Technovit 7100 Heraeus Kulzer <a href="http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm">http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm</a> </li><li> Blok Reçine-Technovit 3040 Histolojik blok, bir Heraeus Kulzer </li></ul> Lekeler (Grale Bilimsel Reaktifler) Goldner Kullanıcı trikrom leke </li> 1. Weigert demir hemotoxylin (DeGroat) <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Hemotoxylin çözüm </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 1g </td></tr><tr><td> Saf alkol </td><td> 100 mL </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Demir Çözüm </td></tr><tr><td> % 30 sulu demir klorür </td><td> 4ml </td></tr><tr><td> Hidroklorik asit (konsantre) </td><td> 1mL </td></tr><tr><td> distile su </td><td> 95mL </td></tr></table> Filtrelenmiş ve eşit hemotoxylin hacmi hemen önce leke kullanılan eklendi. 2. Ponceau-fuksin-azophloxin stok çözümleri <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Ponceau de xylidine çözüm </td></tr><tr><td> Ponceau de xylidine </td><td> 0.75g </td></tr><tr><td> asit fuchsion </td><td> 0.25g </td></tr><tr><td> Asetik asit </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> mix ve distile su (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) azophloxin çözüm </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> Asetik asit </td><td> 0.6mL </td></tr><tr><td colspan="2"> mix ve distile su (100 ml) </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> c) Final çalışma leke çözüm </td></tr><tr><td> Ponceau-fuksin çözüm </td><td> 5-10ml </td></tr><tr><td> Azophloxin </td><td> 2mL </td></tr><tr><td> % 0.2 asetik asit çözeltisi </td><td> 88mL </td></tr></table> 3. Açık Yeşil Çözüm <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Açık Yeşil </td><td> 1g </td></tr><tr><td> asetik asit </td><td> 1mL </td></tr><tr><td colspan="2"> Mix ve distile su (500ml) </td></tr></table> 4. Phophomolybdic asit-Turuncu G çözüm <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Phosphomolybdic asit </td><td> 3g </td></tr><tr><td> Turuncu G </td><td> 2g </td></tr><tr><td colspan="2"> 500ml distile su içinde çözülür ve kristal timol ekleyin. </td></tr></table> Von Kossa KORUYUCU <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> % 1 sulu gümüş nitrat </td></tr><tr><td> % 2,5 sodyum tiyosülfat </td></tr><tr><td> % 1 safranin O </td></tr></table> Alsiyan mavi KORUYUCU <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td> Alsiyan mavi 8GX </td><td> 1g </td></tr><tr><td> % 3 asetik asit çözeltisi </td><td> 100 mL </td></tr></table> Hemotoxylin ve Eozin leke <table style="margin-left:40px;" border="0"><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> a) Harris hemotoxylin </td></tr><tr><td> Hemotoxylin </td><td> 2.5g </td></tr><tr><td> Saf alkol </td><td> 25ml </td></tr><tr><td> Potasyum Şap </td><td> 50g </td></tr><tr><td> distile su </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> cıva oksit </td><td> 1.25g VEYA </td></tr><tr><td> Sodyum iyodat </td><td> 0.5g </td></tr><tr><td> Asetik sirke asidi </td><td> 20ml </td></tr><tr><td colspan="2" style="font-weight:bold;"> b) Eozin çözüm </td></tr><tr><td colspan="2"> Ticari olarak üretilen Eozin kullanılmıştır. </td></tr></table> Tüm leke boya tozları Gurr boya tozları. Bütün çözeltiler analitik reaktifler ve Laboratuar reaktifleri Fluorochromes <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tr><td> Üretici </td><td> Florokrom </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Calcein Yeşil </td><td> C0875 </td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich, Sydney </td><td> Alizarin Complexone </td><td> A3882 </td></tr><tr><td> Intervet Avustralya, Victoria </td><td> Oksitetrasiklin (Raf antimikrobiyal ilaç kapalı) </td><td> Unvanı; Engemycin 100 </td></tr></table>

undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis

Undecalcified kemik histolojisi kemik mikro-mimari göstermektedir. Bu mineralize kemik, kemik döngüsü ve kemik yapım ve yıkım ile ilgili önemli bilgiler sağlar ve hücresel bileşenleri gösterir. Bu, klinik ve araştırma uygulamaları çeşitli büyük bir öneme sahiptir. Çok güzel görüntüler 1 verim ve florokrom değerlendirme ve histomorfometri 2 gibi teknikler sağlar. Florokrom analizi, o bir zamanda mineralizasyon miktarı ölçümü için sağlar belirli bir zaman noktasında, kalsiyum bağlamak floresan boya enjekte edilir bir tekniktir. Histomorfometri mikroskobik düzeyde kemik nicelikleme bir süreçtir. Undecalcified kemik histolojisi Sahne teknik özellikle büyük boyutlu örnekleri zordur. Histoloji gömülü standart parafin kullanılan bu tekniği farklılıklar gerektirir. Bu video kaliteli bölümleri üretim sürecini göstermektedir ve bunların üstesinden gelmek için hangi teknik zorluklar ve yöntemler göstermektedir. Genellikle birkaç hafta Ancak, yoğunluk ve düşük kemik geçirgenliği oldukça uzun fiksasyon ve işlem süreleri gereklidir nedeniyle diğer yumuşak dokularda benzer bir şekilde, numune hazırlama, fiksasyon ve işlenmesi ile elde edilir. Gömme metakrilat esaslı reçineler gibi kemik, benzer ya da eşit sertlik ve yoğunluk ile destekleyici bir ortam kullanılarak, ancak elde parafin infiltrasyon ve gömme aksine, bu geri dönüşü olmayan bir bir adımdır. Kesit florokrom analizi gibi çalışmalar için en uygun kalın bir bölümü, üretir öğütülmesi ile elde edilebilir. Bu iyi bir macrotome bir elmas bıçak kullanılarak elde edilir. Alternatif olarak, ince kısımların ışık mikroskobu için üretilen ve bu çok keskin bir bıçak ile bir kızak mikrotom kullanılarak elde. Kızak mikrotom büyük, sert bloklar için gerekli ek güç ve kararlılık sağlar. Reçine gömülü gösterilmektedir lekeleri çeşitli bölümleri ile boyanmış olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis at JoVE.com

Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

Undecalcified kemik histolojisi, klinik ve araştırma uygulamaların çeşitliliği için önemli bilgiler sağlar. Bu teknik, özellikle büyük boyutlu örnekleri, zordur. Bu video kaliteli bölümleri üretim sürecini göstermektedir ve bunların üstesinden gelmek için hangi teknik zorluklar ve yöntemler göstermektedir.

Histoloji, histomorfometri ve Florokrom Analiz Undecalcified Kemik Hazırlık

Undecalcified bone histology demonstrates the micro-architecture of bone. It shows both the mineralised and cellular components of bone, which provides ...

undecalcified-bone-preparation-for-histology-histomorphometry

Research

JoVE Journal

Biology

27.1K Görüntüleme.  Monash University. Undecalcified kemik histolojisi, klinik ve araştırma uygulamaların çeşitliliği için önemli bilgiler sağlar. Bu teknik, özellikle büyük boyutlu örnekleri, zordur. Bu video kaliteli bölümleri üretim sürecini göstermektedir ve bunların üstesinden gelmek için hangi teknik zorluklar ve yöntemler göstermektedir.

Video: Undecalcified Bone Preparation for Histology, Histomorphometry and Fluorochrome Analysis

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biyoloji

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing bone, they also support the complex process of bone regeneration. This favorable behavior of autografts is attributed to the three characteristics: osteoconductivity, osteogenicity, and osteoinductivity. However, there is another aspect: Bone grafts release a myriad of molecules, including growth factors, which can target mesenchymal cells involved in bone regeneration. The paracrine properties of bone grafts can be studied in vitro by the use of bone-conditioned medium (BCM). Here we present a protocol on how to prepare bone-conditioned medium from native pig cortical bone, and bone that underwent thermal processing or demineralization. Cells can be directly exposed to BCM or seeded onto biomaterials, such as collagen membranes, previously soaked with BCM. We give examples for in vitro bioassays with mesenchymal cells on the expression of TGF-&#946; regulated genes. The presented protocols should encourage to further reveal the paracrine effects of bone grafts during bone regeneration and open a path for translational research in the broad field of reconstructive surgery.

We describe here how to prepare bone-conditioned medium (BCM) and test its activity in vitro.

Kemik koşullu ortam: Hazırlama ve Biyo-

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities for deep analysis well beyond what is possible with conventional fluorescence-based flow cytometry. As with any new technology, there are critical steps that help ensure the reliable generation of high-quality data. Presented here is an optimized protocol that incorporates multiple techniques for the processing of cell samples for mass cytometry analysis. The methods described here will help the user avoid common pitfalls and achieve consistent results by minimizing variability, which can lead to inaccurate data. To inform experimental design, the rationale behind optional or alternative steps in the protocol and their efficacy in uncovering new findings in the biology of the system being investigated is covered. Lastly, representative data is presented to illustrate expected results from the techniques presented here.

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Tissue Collection and RNA Extraction from the Human Osteoarthritic Knee Joint

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty (TKA) is a common surgical intervention. Experiments using primary human OA tissues obtained from TKA provide the capability to investigate disease mechanisms ex vivo. While OA was previously thought to impact mainly the cartilage, it is now known to impact multiple tissues in the joint. This protocol describes patient selection, sample processing, tissue homogenization, RNA extraction, and quality control (based on RNA purity, integrity, and yield) from each of seven unique tissues to support disease mechanism investigation in the knee joint. With informed consent, samples were obtained from patients undergoing TKA for OA. Tissues were dissected, washed, and stored within 4 h of surgery by flash freezing for RNA or formalin fixation for histology. Collected tissues included articular cartilage, subchondral bone, meniscus, infrapatellar fat pad, anterior cruciate ligament, synovium, and vastus medialis oblique muscle. RNA extraction protocols were tested for each tissue type. The most significant modification involved the method of disintegration used for low-cell, high-matrix, hard tissues (considered as cartilage, bone, and meniscus) versus relatively high-cell, low-matrix, soft tissues (considered as fat pad, ligament, synovium, and muscle). It was found that pulverization was appropriate for hard tissues, and homogenization was appropriate for soft tissues. A proclivity for some subjects to yield higher RNA integrity number (RIN) values than other subjects consistently across multiple tissues was observed, suggesting that underlying factors such as disease severity may impact RNA quality. The ability to isolate high-quality RNA from primary human OA tissues provides a physiologically relevant model for sophisticated gene expression experiments, including sequencing, that can lead to clinical insights that are more readily translated to patients.

Primary tissues obtained from patients following total knee arthroplasty provide an experimental model for osteoarthritis research with maximal clinical translatability. This protocol describes how to identify, process, and isolate RNA from seven unique knee tissues to support mechanistic investigation in human osteoarthritis.

İnsan Osteoartrit Diz Ekleminden Doku Toplama ve RNA Ekstraksiyonu

Osteoarthritis (OA) is a chronic and degenerative joint disease most often affecting the knee. As there is currently no cure, total knee arthroplasty ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Kök Eksüdalarında Rhizobacterial Kemoattractants'ın Hızlı Tanımlanması için Geliştirilmiş Bir Kemotaksi Tahlili

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Endokondral Ossifikasyon Yoluyla Kemik Rejenerasyonu için Yapay Kıkırdak İmplantları

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it does not have a mechanism to induce angiogenesis. Implanting artificial cartilage tissue fabricated from MSCs induces angiogenesis and bone formation in vivo via endochondral ossification (ECO). Therefore, this ECO-mediated approach may be a promising bone regeneration therapy in the future. An important aspect of the clinical application of this ECO-mediated approach is establishing a protocol for preparing enough cartilage to be implanted to repair the bone defect. It is especially not practical to design a single mass of grafted cartilage of a size that conforms to the shape of the actual bone defect. Therefore, the cartilage to be transplanted must have the property of forming bone integrally when multiple pieces are implanted. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification to meet clinical requirements. Although many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo, the optimal scaffold material to meet the needs of clinical applications has yet to be determined. Hyaluronic acid (HA) is a crucial component of the cartilage extracellular matrix and is a biodegradable and biocompatible polysaccharide. Here, we show that HA hydrogels have excellent properties to support in vitro differentiation of MSC-based cartilage tissue and promote endochondral bone formation in vivo.

Yazar Spotlight: Vaskülarize Yapay Kıkırdak Entegrasyonu ile Kemik Rejenerasyonunun Artırılması 

Bone therapy via endochondral ossification by implanting artificial cartilage tissue produced from mesenchymal stem cells has the potential to circumvent the drawbacks of conventional therapies. Hyaluronic acid hydrogels are effective in scaling up uniformly differentiated cartilage grafts as well as creating integrated bone with vascularization between fused grafts in vivo.

Mezenkimal Kök Hücreler Kullanılarak İn Vivo Endokondral Ossifikasyon Yoluyla Entegre Kemik Oluşumu

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...