Bu modifiye ATAC-seq protokolü, mitokondriyal okumaların kontamine sini azaltan yeni bir lisis tamponunu %50'den %3'ün daha az azaltan mitokondriyal kontaminasyonun azalması araştırmacıların sıralama maliyetlerinde %50'lik bir düşüşle daha verimli ATAC-seq yapmalarını sağlayacaktır. Bu yeni ATAC-seq protokolünü insan primer PBMC'lerinde, insan primer monositlerinde, fare dendritik hücrelerinde ve melanom hücre hatlarında doğruladık. Çok çeşitli hücre tiplerinde etkili olacağına inanıyoruz.
Hücre aktivasyonu ve seçim sürecinde örnek kaybını en aza indirmek, ATAC-seq ile yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. Temel laboratuvar ekipmanlarını kullanarak değerli numunelerden az sayıda hücrenin nasıl işleyeceğini göstereceğiz. Başlamak için, buz eriyene kadar 37 derecelik santigrat su banyosunda önceden izole edilmiş CD4+T hücrelerinden oluşan bir şişeyi eritin.
Daha sonra hücreleri hafifçe, önceden ısıtılmış tam RPMI'nin dokuz mililitresini içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 1, 500 kat G ve dört santigrat derecede altı dakika santrifüj edin. Sonra supernatant atın ve yavaşça tam RPMI iki mililitre pelet resuspend.
Santrifüjü tekrarladıktan sonra, süpernatantı atın ve hücreleri 0,5 mililitre tam RPMI'de yavaşça askıya alın. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın. Tam RPMI kullanarak, hücre süspansiyon yoğunluğunu 96 kuyulu yuvarlak alt plakanın kuyusu başına 200 mikrolitrede 50, 000 CD4+hücreye ayarlayın.
Daha sonra, manyetik boncukhazırlamak için, 1.5 mililitrelik bir tüp aTAC-seq örnek başına İnsan T-Aktivatör CD3/CD28 boncuk 12.5 mikrolitre aliquot. Tüpe bir mililitre 1x PBS ekleyin ve boncukları yıkamak için bir dakika lığına mıknatısın üzerine yerleştirin. Dikkatle kaldırmak ve net supernatant atın ve mıknatıs tan tüp çıkarın.
ATAC-seq numunesi başına 13 mikrolitre komple RPMI boncukları yeniden askıya alın. Cd4+T hücrelerini ayarlanmış konsantrasyonla etkinleştirmek için, 15 mililitrelik konik bir tüpte 2,1 mililitre tam RPMI ortamında 500,000 hücre toplayın. İnsan T-Aktivatör boncuk12,5 mikrolitre ekleyin, hazırlanan ve önceki adımlarda yıkanmış, ve yavaşça tüp ters karıştırarak.
Sonra yavaşça steril bir rezervuar için, boncuk ile hücreleri aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, yuvarlak dipli 96 kuyulu bir plakanın kuyusuna boncuk içeren 200 mikrolitre hücre plakası ve 48 saat boyunca 37 derece santigrat, %5 CO2 kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın. Tam kuluçkadan sonra, plakayı 423 kez G ve oda sıcaklığında sekiz dakika santrifüj edin.
Her kuyudan 100 mikrolitre orta litre çıkarın ve boncuk kaybını doğrulamak için atmadan önce konik bir tüpte toplayın. Daha sonra orta kalan 100 mikrolitre hücre pelet resuspend ve 1.5 mililitrelik bir tüp her şeyi toplamak. CD4+hücrelerini izole etmek için, 50 mikrolitre önceden yıkanmış CD4 konjuge boncukları bir mililitre lik tam RPMI'de 500, 000 hücreye ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin.
Dört santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yat, karıştırmak için her altı dakikada bir el ile hareket ettirin. Tüpü iki dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin, ta ki supernatant temiz olana kadar, ve sonra çıkarıp atın. Tüpü mıknatıstan çıkarın.
Boncuk la bağlı hücreleri bir mililitre PBS,artı %2 FCS'de yeniden suyararak yıkayın ve tüpü bir dakika lığına mıknatısın üzerine yerleştirin. Açık supernatant atın ve üç yıkar toplam için bu işlemi tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, bir dakika için mıknatıs üzerinde tüp yerleştirin.
Çıkarın, supernatant atın ve buz üzerine pelet yerleştirin. Daha sonra, çekirdek izolasyongerçekleştirmek için, soğuk lysis tampon 50 mikrolitre boncuk ve hücreleri yeniden askıya almak ve santrifüj hemen 500 G, dört derece santigrat, 10 dakika. Supernatant'ı çıkarın ve atın.
Transposaz reaksiyonu gerçekleştirmek için, 50 mikrolitre Tn5 transposaz karışımı ile izole çekirdek pelet resuspend. 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir termocycler inkübün, kapak 40 santigrat derece ayarlanmış, ve sonra tamamlandığında dört derece santigrat tutun. Termobisikletten hemen sonra, hızlı bir tezgah üstü santrifüj spin-down gerçekleştirin.
Üründen boncukkaldırmak için bir dakika için mıknatıs üzerine tüp yerleştirin. Mıknatıstan tüpü çıkarmadan, berrak süpernatant'ı DNA arıtma sütununa aktarın. Kolonu 250 mikrolitre PB tamponu ve 750 mikrolitre PE tamponu ile iki kez yıkayın.
Daha sonra numuneyi uzaklaştırmak için 10 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyin. Nucleaz içermeyen bir PCR tüpte ilk PCR amplifikasyon reaksiyonu ayarlayın. PCR tüpünü termocycler'a yerleştirin ve PCR amplifikasyon programını çalıştırın.
Daha sonra, el yazmasında açıklandığı gibi kalan 45 mikrolitre PCR reaksiyonunun son PCR amplifikasyonunu tamamlayın. PCR tüpünü termocycler'a yerleştirin ve programı çalıştırın. Tam amplifikasyon sonra, bir PCR temizleme kiti kullanarak kütüphaneler arındırın, üreticinin protokolünü izleyerek, elüsyon arabelleği 25 mikrolitre eluting.
Hazırlanan kitaplıkları yeni nesil bir sıralayıcıda, örnek başına ortalama 42 milyon okuma derinliğine sıralayın. Bu geliştirilmiş ATAC-seq protokolü sıralama için mikrolitre başına bir nanogramdan daha büyük bir son kütüphane üretti. Kalite kontrol 200 ve 1,000 baz çifti arasında DNA parçaları gösterdi ve daha fazla sıralama bu yüksek kaliteli kütüphaneler ile yapıldı.
Bu protokol den sonra hazırlanan kütüphaneler de sadece %3 mitokondriyal kontaminasyon gösterdi. Kullanılabilir okumaların yüksek yüzdesi biyolojik çoğaltmalar arasında yeterince sabittir. Bu protokol, biyolojik kopyaların yanı sıra teknik kopyalar arasında son derece tekrarlanabilir sonuçlar sağladı.
Ayrıca, bu protokol, daha önce açıklandığı gibi bir hafta veya daha fazla değil, 48 saat sürdü ve tekrarlanabilir sıralama sonuçlarıyla gösterildiği gibi tutarlı ve verimli etkinleştirme yle sonuçlandı. Ayrıca, tahmin ATAC-seq zirveleri doğru analiz boru hattı tarafından çağrıldı. Sıralama sonucu analizi insan T hücre aktivasyonu sırasında kromatin durumunda net değişiklikler ortaya koymuştur.
Açık kromatinin farklı olarak erişilebilen bölgeleri aktivasyondan önce ve 48 saat sonra altı örnek arasında tanımlanmıştır. Bozulmamış çekirdeklerin geri kazanımını en üst düzeye çıkarmak için çekirdekli lysis reaksiyonunun soğutulmuş reaktifler ve malzemelerle yapıldığından emin olun. Modifiye çekirdekli lysis tamponumuz hücrelerde daha naziktir ve mitokondriyal DNA'yı kirleten en aza indirir.
Bu modifiye lisis tamponunun tek çekirdekli ATAC-seq'a da uygulanmasını dört gözle bekliyoruz. Bu protokolün araştırmacıların daha yüksek kaliteli ATAC-seq verilerini daha düşük bir maliyetle üretmesine olanak sağlayacağını biliyoruz ve epigenetik alanın iletilmesine yardımcı olacaktır. Protokol basit, hızlı ve herhangi bir tehlikeli reaktif veya enstrüman gerektirmez, atac-seq yeni olanlar için kolayca erişilebilir hale.
