Yaşlanma sonuçta organizmaölümü olasılığını artırır birden fazla hücresel süreçlerin zamana bağlı bozulma ile karakterizedir. Bir popülasyon içinde bu süreç değişkendir ve bir dizi genetik ve çevresel faktör onu etkileyebilir. En iyi çalışılan ve anlaşılan değişkenlerden biri diyetin yaşam süresindeki rolüdür.
Diyet kısıtlaması sonuçta yaşlanma ve yaşlanma ile ilişkili değişikliklerin başlangıcı geciktirir bir müdahaledir. Bu, bir organizmanın yaşam süresini ve sağlık süresini veya bir organizmanın normal, sağlıklı bir yaşama sahip olduğu süreyi artırır. Mevcut anlayışımız, mutasyonların birikmesi, telomerlerin disregülasyonu, protein homeostazı kaybı, solunum problemleri ve reaktif oksijen türleri gibi yaşlanmanın ayırıcı özellikleri olarak adlandırılan farklı hücresel değişikliklerin tanımlanmasına yol açmıştır.
Bu anlayışın çoğu birçok farklı model organizmayı kullanan çalışmalardan gelmektedir. Yaşam süresini kısaltan ve uzatan genleri tanımlayan birçok genetik ekran var. Ve bu tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae, bu metodolojinin odak noktası olan çalışmalar, c.elegans ve murine sistemi gibi daha karmaşık çok hücreli organizmalar üzerinde çalışmalar içerir.
Bu rağmen, tomurcuklanan maya özellikle kısa doğal ömrü ve karmaşık genetik ilişkileri çözebilir genetik yaklaşımlar bir dizi nedeniyle yaşlanma çalışmaları için münasip olduğunu, yaşlanma genetik fonksiyonel diseksiyon için mükemmel bir sistem yapma. Maya yaşlanma birkaç farklı yönlerini incelemek için kullanılabilir. Ve kronolojik yaşam süresine odaklanacağız, ki bu bir hücrenin hayatta kabileceği süredir.
Bu çalışmanın amacı, aşırı ifade bastırıcı ekran gerçekleştirmek için basit bir genetik yaklaşım sunmaktır. Anormal derecede kısaltılmış kronolojik yaşam süresiyle sonuçlanan genetik bir arka plan dan yararlanacağız. Ve kısaltılmış yaşam süresi fenotipini kurtarabilecek veya bastırabilecek genleri tanımlamak için hedefe yönelik bir yaklaşım kullanacağız.
İlk genetik arka plan maya bir otofaji-eksik suş olduğunu. Kendi kendini yeme olarak tercüme edilen otofaji, proteinler ve organeller gibi sitozolik ürünleri lizozoma ulaştırmak için hücre içi bir bozulma sistemidir. Bu hasarlı proteinleri ortadan kaldırarak hücresel homeostaz korumaya yardımcı olur, hem de bu yaşamlarını uzun yaşamış olanlar.
ATG1 genini silen mutant bir türle çalışacağız. Sitoplazmadan vakuol hedefleme yolunda vezikül oluşumu ve otofaji için gerekli olan protein serine/treonin-protein kinaz için ATG1 kodları. ATG1 null mutant anormal kısa kronolojik ömrü olan bir fenotip vardır.
Bu yaşlanma laboratuarında, ATG1 null mutant'ın anormal derecede kısaltılmış kullanım ömrü özelliğini kurtarabilecek veya bastırabilecek genetik faktörleri tasarlayıp test edeceğiz. Ancak, bu diğer kısa ömürlü genetik arka planlar için de genişletilebilir. Bu işlemin ilk adımı, ömrünü uzatmakla bağlantılı bir geni tanımlamaktır.
Özellikle aşırı ifade edildiklerinde kronolojik ömrünü uzatan genlere odaklanacağız. Bunu yapmak için, maya genom veritabanından erişilebilen kamuya açık verileri kullanacağız. Buraya çıkacağız.
Fenotip ile ara. Ve yolun ortasına doğru, kronolojik ömrünü seçebileceğimizi göreceğiz. Yaşam süresini artıran genleri aramak için, bu özel fenotiple bağlantılı genlere sahip mevcut veri zenginliğini görebilirsiniz.
Bugün, sir2, bir histone lizin deacetylase üzerinde aşırı ifade edildiğinde genişletilmiş kronolojik ömrü ile bağlantılı bir çalışma olacak. Yapacağımız ilk şey kodlama bölgesinin DNA dizisine ve bu genin her iki tarafını çevreleyen düzenleyici bölgelere erişmek. Tüm düzenleyici bölgeleri kapsadığından emin olmak için 400 baz çiftini akıntıya ve akıntıya götüreceğiz.
Bu DNA dizisini, bu geni plazmid vektörümüze klonlamamızı sağlayacak PCR astarlarını tasarlamak için kullanacağız. Genimizi yükseltmek ve pRS315 vektörüne klonlamak için PCR kullanacağız. Bunu yapmak için, HindIII ve SacII kısıtlama siteleri içeren kısıtlama sindirim siteleri içeren astarlar tasarlayacaktır.
Gördüğünüz gibi, plazmid klonlama kolaylaştıracak hem kısıtlama siteleri, HindIII ve SacII içerir. PCR astarlarınızı, yükseltmek istediğiniz bölgeye yaklaşık 21 veya 22 nükleotit içeren bir dizi içerecek şekilde tasarlamanız gerekir. Diziye ek olarak, bunların beş asal ucuna uygun kısıtlama bölgesini ekleyeceksiniz, ya hindIII ileri astarda, ya da sacii ters astarda, burada sırasıyla kırmızı ve mor olarak gösteriliyor, ve bunun daha yukarısında, kısıtlama enziminin bağlanmasına ve daha yüksek bir verimlilikte kısıtlama sindirim bölgesi oluşturmasına olanak sağlayacak birkaç nükleotit ekleyeceğiz.
YPAD gibi zenginleştirilmiş medyada günlük sonrası aşamaya bir gecede yabani tip maya beş mililitrelik kültür büyütün. Mantar genomik izolasyoniçin özel bir ticari kiti kullanarak genomik DNA hasat. Onlar nüfuz etmek için çok sert ve sert bir hücre duvarı var gibi kiti, maya için özel olması önemlidir.
Zymolyase tedavisi hücre duvarının sindirilmesinde etkilidir ve genomik verimi büyük ölçüde artırır. DNA miktarını ve kalitesini belirlemek için bir spektrofotometre kullanın. Klonlamaya uygun bir amplikon üretmek için, amplifikasyon işlemi sırasında mutasyonları önlemek için yüksek kaliteli PCR polimeraz kullanmak gerekir.
Ticari olarak kullanılabilir birçok farklı yüksek sadakat PCR kitleri vardır. Reaksiyonun optimizasyonunu kolaylaştırmak için, standart yüksek doğruluk arabelleği olan ve karmaşık ampliconlarda yüksek GC içeriği için optimize edilmiş birden çok arabellek sistemi sağlayan bir kit seçmenizi öneririz. Genomik DNA'mızdan 200 nanogram ekleyeceğiz.
Tamponumuzdan beş mikrolitre ekleyeceğiz. 2,5 mikrolitre ileri ve ters astarlarımızı ekleyeceğiz. Bir mikrolitre polimeraz, iki mikrolitre D NTP ekleyeceğiz.
Ve son olarak, 50 mikrolitreye ve steril distile suya verilen tüm reaksiyonu QS'ye gidiyoruz. Reaksiyonu, kullandığımız enzime ve bu deneyde tasarladığımız astarlara özgü protokole göre çalıştıracağız. PCR reaksiyonu temizleyin ve konsantre olun.
Seçici medyada bir gecede E.coli beş mililitrelik kültür büyümek. Pelet santrifüj ile kültür ve supernatant atın. Verilen chaotropic tampondaki hücreleri beş dakika süreyle yeniden askıya alın ve lyse.
Reaksiyonu nötralize edin ve ikisini beş ya da altı kez ters çevrilerek karıştırın. Numunenizi maksimum hızda 10 dakika santrifüj edin. Supernatant ve bir silika sütuna aktarın ve sağlanan tampon ile yıkayın.
Akışı atın ve her biri sonra akışınızı atarak, arasında 30 saniyelik santrifüjler ile, diğer uygun tamponlar ile yıkama tekrarlayın. Sonunda, herhangi bir kalıntı etanol kaldırmak ve 20 mikrolitre elüsyon tampon içine plazmid elute ve spektrofotometre ile miktar ve kalite belirlemek için iki dakika daha fazla santrifüj. Şimdi vektör ve eklemek bir kısıtlama sindirim kurmak için zamanı.
625 nanogram DNA ekleyin, vektör veya kesici uç, CutSmart tampon beş mikrolitre, SacII bir mikrolitre, HindIII bir mikrolitre, ve QS su ile reaksiyon 50 mikrolitre son reaksiyon hacmi getirmek için. Restriksiyon 37 santigrat derece üç saat sindirir, ardından 80 santigrat 20 dakika ısı ve enzimleri aktive. Bu noktada, özetler bir sonraki adıma geçmeden önce dört derecede saklanabilir.
Daha sonra, sindirilmiş genomik parçamızı kullanarak 15 mikrolitrelik bir ligasyon kuracağız. Altı mikrolitre su ekleyerek başlayacağız. Sindirilmiş vektörümüzden iki mikrolitre ekleyeceğiz.
Bu bizim pRS315 plazmidimiz. Kesici uçumuzdan dört mikrolitre ekleyeceğiz, SIR2 geni. Ligaz tamponumuzdan iki mikrolitre ekleyeceğiz.
Ve son olarak, bir mikrolitre ligaz ekleyeceğiz. Bunu bir gecede 16 derecede kuluçkaya yatıracağız ve sonra ısı enzimi 80 derecede 20 dakika boyunca öldürecek. Başarılı bir şekilde yaratılmış plazmidimizi taramak için onu E.coli'ye dönüştüreceğiz.
50 mikrolitre kimyasal madde kullanacağız. Onları buzda eriteceğiz ve çözülür çözülmez ligasyon tepkimizi ekleyeceğiz, tüm içeriğini ekleyeceğiz. Bu yüzden ekletme ile 15 mikrolitre ligasyon ekleyeceğiz, ve 15 mikrolitre no-in-in-sert kontrolümüzü de ayrı bir reaksiyona ekleyeceğiz.
Eklendikten sonra, karıştırmak için tüpü birkaç kez hafifçe kaydırın. Ve bunu buzda kuluçkaya yatıracağız. Buzdaki 30 dakikalık kuluçkayı tamamladıktan sonra, örneklerimizi 42 derecelik bir ısıtma bloğuna ekleyeceğiz.
Isı şokundan sonra iyileşme sürecine izin vereceğiz. Örneklerimizi alacağız ve 450 mikrolitre SOC medyası ekleyeceğiz. Plazmidlerin alınmasına ve ampisilin direnci geninin ifade edilebilmesi için bunları 37 santigrat derecede kuluçkaya yatıracağız.
Bu örneklerin 37 derecede 45 dakika boyunca toparlanmasına izin veririz. Bu kuluçkadan sonra, bir ila 10, ve 100'e kadar seyreltme ler kurduk, ve bunları LB/Amp ortamlarına alacağız ve hücrelerin bir gecede büyümesine izin vereceğiz. Steril teknikle tabaklatacağız.
Uygun plakayı alacağız, ki buna göre etiketledik ve seçilebilir işaretçimizi içerir. Dönüştürülmüş E.coli'mizin 150 mikrolitresini alacağız. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, daha sonra yavaşça boyunca hücreleri yayacak ve plakanın bütünü boyunca böylece güzel bir eşit dağılım elde edeceğiz.
Tüm seyreltmelerimizi tamamladıktan sonra, bu tabakları bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatıracağız. Yaklaşık bir gün sonra, yaratmaya çalıştıklarımız plazmidi içeren kolonilerin büyüdüğünü görmeliyiz. Buna benzer bir şey olmalılar.
Steril tekniği kullanarak, daha önce özetlenen prosedürü takiben beş mililitre LB artı ampisilin dönüşümünüzü n içinden büyüyen potansiyel transformatanları aşılamak. Her potansiyel transformant plazmidler izole ve daha önce açıklandığı gibi bir kısıtlama sindirim çalıştırın. Reaksiyon ürünlerini bir agarose jel üzerinde çalıştırın, potansiyel transformatanları boş vektörle karşılaştırın.
Daha fazla çalışma için düzgün büyüklükteki bir kesici uç eksizyonuna neden olan dönüştürücüleri kaydedin. Plazmidimizi başarıyla yarattıktan sonra, onu ATG1 null maya arka planına dönüştüreceğiz. 15 millik hücre alacağız ve onları peletleyeceğiz.
Peleted sonra, onlar büyüyen YPAD medya kaldırmak ve distile su ile hücreleri yıkayın. Ondan sonra hücreleri alacağız ve 100 milibünli lityum asetatla tekrar askıya alacağız. 200 mikrolitrelik bir alanda tekrar askıya alacağız.
Hücre peletini hafifçe yukarı ve aşağı borular oluşturarak yeniden askıya alın. Bu karışımın dönüşüm başına 50 mikrolitresini kullanarak, gerçekleştireceğiniz dönüşümlerin her biri için hücreleri ayrı mikrofuge tüplere bölün. Dönüşümlerin her biri için 240 mikrolitre %50 PEG eklemeniz gerekir.
PEG çok viskoz, pipet ve çok dikkatli ölçmek. PEG ilavesi ve ek bileşenlerin her biri sonra pipetleme ile karıştırın. Sonraki bir molar lityum asetat 36 mikrolitre ekleyin, somon sperm DNA beş mikrolitre, ya da diğer taşıyıcı DNA, beş dakika için haşlanmış ve buz üzerine yerleştirilmiş, ve son olarak her dönüşüm için plazmid beş mikrolitre gerçekleştirecek.
Girdap her tüp iyice karıştırmak için. Numunelerinizi 30 santigrat derecede 45 dakika kuluçkaya yatırın. Isı 10 dakika boyunca 42 santigrat derecede onları şok, ve sonra steril suda bir kez hücreleri yıkayın, nihayet steril su 200 mikrolitre onları resuspend.
Plazmidler için seçmek için SC eksi ley plakaları üzerine maya ve plaka 150 mikrolitre dönüştürülmüş suşları her biri 1 ila 100 seyreltme bir ayarlayın. Hücreleri düzgün ve eşit olarak yayın ve plakaların ters çevirmeden ve 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırmadan önce kurumasını sağlayarak 48 ila 72 saat büyümelerini bekleyin. Test etmek için genimizi başarıyla klonladıktan sonra organizmanın kronolojik ömrü üzerindeki etkisini test edeceğiz.
Mayayı büyüteceğiz, zamanın bir fonksiyonu olarak kalan uygun koloni oluşturan birimlerin sayısını izleyeceğiz. 30 santigrat derece sallayarak SC eksi lösin sıvı ortamda 72 saat boyunca ilk maya büyümek. Bir hemositometre kullanarak, 500 hücreleri plaka izin vermek için gerekli seyreltme belirleyin.
Steril tekniği kullanarak, hücreleri bir SC eksi leyplakasına plakalayın, kurumasını ve 30 santigrat derecede üç gün boyunca ters çevrilmesine izin verin, bu noktada büyüyecekler ve koloninin büyümesini kaydedin ve bu zaman noktasını kaydedebilirsiniz. Plaka yaptıktan sonra, sallayarak olmadan 30 santigrat derece maya kuluçkaya devam edin. Başlangıçta, ön verilerimiz yaşlanma fenotipinin bastırılmasına işaret ediyorsa, daha sık zaman puanları alarak, kaplamayı haftalık aralıklarla tekrarlarız.
Yüzde canlılığı belirlemek için, analiz için bir saat noktasına normalleştiririz. Her aralıkta aynı seyreltme plaka emin olun. Artık büyüyen koloniler görene kadar bu işlem ile devam edin.
Bilgilerinizi bir Excel elektronik tablosuna girmeniz yararlı olur. Bu, deneyin sonunda her bir zorlanmanın uygulanabilirliğini hızlı bir şekilde belirlemenize olanak sağlayacaktır.
