La préparation d’échantillons compatibles masse-spectrométrie de haute qualité pour une analyse complète du protéome d’échantillons oculaires est essentielle pour élucider les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation impliqués dans la santé et la maladie. Le flux de travail décrit représente une approche simple mais robuste des étapes rigoureuses de préparation des échantillons, qui s’adresse spécifiquement à l’analyse d’échantillons limités en masse tels que les micro vaisseaux sanguins oculaires. Bien que l’objectif principal de l’étude soit d’établir une méthodologie compatible avec la SP pour les vaisseaux sanguins oculaires, le flux de travail décrit peut être largement appliqué à divers échantillons à base de cellules et de tissus.
En général, les personnes nouvelles à cette méthode peuvent avoir du mal parce que l’identification et l’isolement de l’artère ciliaire postérieure courte choisie, ou branches de la SPCA, peuvent être difficiles. Les yeux frais de porcin, avec le nerf optique et les tissus extraoculaires, ont été obtenus de l’abattoir local immédiatement post-mortem. Placez le globe oculaire dans une chambre de dissection contenant du tampon krebs-henseleit glacé.
Coupez soigneusement les muscles et les tissus environnants à l’aide d’une paire de ciseaux Mayo pointus. Faire une incision avec un scalpel, et couper le globe le long du plan équatorial avec une paire de ciseaux Mayo forte jusqu’à ce que l’œil est séparé dans les moitiés antérieures et postérieures. Retirez autant de corps vitreux que possible de la moitié postérieure de l’œil à l’aide d’une paire de forceps de modèle standard.
Après avoir utilisé des broches de dissection pour épingler soigneusement la moitié postérieure de l’œil, couper délicatement les tissus conjonctifs entourant le nerf optique, pour exposer la vascularisation rétrobulbar sous-jacente avec une paire de ciseaux à ressort Vannas étudiant. Isoler l’artère ciliaire postérieure courte paraoptique et distale ainsi que les tissus conjonctifs environnants avec une paire de pinces de précision de type cinq et des ciseaux de capsulotomie Vannas. Retirez délicatement les tissus conjonctifs des segments artériaux à l’aide de pinces à épiler et de ciseaux à pointes extra fines avant de rincer les artères isolées dans le PBS glacé pour éliminer les contaminants et les résidus sanguins.
Piscine artères de deux yeux pour obtenir une réplique biologique, puis peser les échantillons à l’aide d’un équilibre analytique. À chaque tube, ajouter un mélange de perles d’oxyde de zirconium de 0,5 et d’un millimètre suivies d’un réacolteur d’extraction de protéines tissulaires. Maintenant, chargez les tubes d’échantillon dans un homogénéiseur de mélangeur.
Réglez la minuterie à deux minutes, réglez le niveau de vitesse à six et commencez l’homogénéisation. Après avoir couru, vérifiez les échantillons pour une homogénéisation complète et gardez des échantillons sur la glace entre chaque course. Répétez le cycle jusqu’à ce que les échantillons soient complètement homogénéisés.
Pipette soigneusement homogénéisé en tubes de microcentrifugeuses fraîches. Centrifuger les échantillons à 10 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les protéines insolubles. Pipette soigneusement le supernatant contenant les protéines solubles sans toucher la couche de granulés, et transférer dans des tubes de microcentrifugeuse fraîche.
Ajouter 200 microlitres d’Extraction Buffer 2A et cinq microlitres de cocktail inhibiteur de la protéase à chaque échantillon de granulés. Ensuite, suspendre la pastille plusieurs fois avec une pipette. Utilisez un homogénéiseur ultrasonique pour homogénéiser complètement la pastille.
Réglez l’amplitude à 60 et cycle à un. Utilisez une sonde en titane, qui convient à l’homogénéisation des échantillons avec de petits volumes. Plongez la sonde dans le mélange tampon de granulés et d’extraction sur la glace, et appuyez sur le bouton de démarrage.
Sonicate l’échantillon jusqu’à ce que les touffes de granulés sont complètement homogénéisés, s’arrêtant pendant quelques secondes entre chaque sonication. Vérifiez visuellement l’homogénéisation complète. Mélanger l’homogénéité plusieurs fois avec une pipette pour s’assurer qu’il n’y a pas de touffes.
Utilisez des dispositifs de filtre centrifuge avec coupure de trois kilodaltons pour cette procédure. Insérez l’unité de filtre de coupure de trois kilodaltons dans un tube de microcentrifugeuse. Pipette 200 microlitres d’homogénéisation d’échantillon à un dispositif de filtre, et ajouter 200 microlitres d’eau déionisée dans le même filtre.
Après l’avoir plafonné en toute sécurité, placez l’unité filtrante dans une centrifugeuse, et tournez pendant 14 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, séparer l’unité filtrante contenant le concentré de l’échantillon du tube de microcentrifugeuse contenant le filtrate, en jetant le filtrate. Reconstituer le concentré en ajoutant 400 microlitres d’eau déionisée dans l’unité de filtration.
Après avoir répété la filtration trois fois, pipette soigneusement le concentré d’échantillon nettoyé dans un microtube propre. Préparer les échantillons pour l’électrophoresis gel unidimensionnel tel que énuméré dans le protocole de texte, et bien mélanger avec une pipette. Chauffer les échantillons à 70 degrés Celsius dans un chauffe-bloc sec pendant 15 minutes et laisser refroidir à température ambiante.
Chargez soigneusement 50 microgrammes d’échantillon par voie à l’aide d’une pipette, ainsi que la norme de protéines prétachées comme marqueur de masse moléculaire. Faire fonctionner les gels pendant environ 60 minutes à une tension constante de 175 volts. À la fin de la course, retirer délicatement le gel de la plaque à cassette à l’aide d’un couteau à gel et transférer le gel dans une boîte à taches de gel.
Effectuer la fixation et la coloration du gel tel que décrit dans le protocole de texte. Secouez les gels dans la solution de coloration pendant la nuit pour obtenir de meilleurs résultats globaux. Décanter soigneusement la solution de coloration et remplacer par 200 millilitres d’eau déionisée avant de secouer les gels pendant au moins sept à huit heures dans l’eau pour dégager l’arrière-plan.
Exciser les bandes protéiques du gel avec de nouvelles lames de microtomées propres. Couper la bande en petits morceaux et transférer délicatement les morceaux de gel en tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajouter 500 microlitres de solution de destaining contenant 100 millimolar ammonium bicarbonate et acetonitrile.
Incuber les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes, avec des secousses occasionnelles. Pipette soigneusement la solution de destaining. Vérifiez visuellement tous les tubes avec tache résiduelle, et répétez cette étape si les morceaux de gel sont encore tachés de bleu.
Ajouter environ 400 microlitres de solution de TNT fraîchement préparée et incuber à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après avoir jeté la solution de réduction avec une pipette, ajouter environ 400 microlitres de solution IAA fraîchement préparée, et incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 minutes. Retirer le tampon alkylating à l’intérieur d’une pipette et jeter.
Ajouter 500 microlitres d’acétyonitrile soignée à température ambiante pendant 10 à 15 minutes, jusqu’à ce que les morceaux de gel rétrécissent et deviennent opaques. Pipette sur l’acetonitrile, et sécher à l’air les morceaux de gel pendant cinq à 10 minutes sous le capot. Ensuite, pipette 50 microlitres de solution trypsine dans chaque tube pour couvrir complètement les morceaux de gel, et incuber les tubes à quatre degrés Celsius.
Après 30 minutes, ajouter suffisamment de volume de tampon trypsine pour couvrir complètement les morceaux de gel si nécessaire. Incuber les échantillons pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Pour effectuer l’extraction du peptide, pipette soigneusement la solution de peptide extrait des tubes et le transfert vers des microtubes propres.
Séchez le supernatant dans un évaporateur centrifuge. Ajouter 100 microlitres de tampon d’extraction à chaque tube avec des morceaux de gel, et incuber pendant 30 minutes avec des secousses. Pipette le supernatant dans les mêmes microtubes contenant les peptides extraits selon leurs bandes respectives, et sécher dans une centrifugeuse sous vide.
Procéder à la purification du peptide et à l’ionisation chromatographie-électrospray liquide MS/MS, tel que décrit dans le protocole textuel. La quantité totale de protéines dans les échantillons extraits avec chaque type de détergent est représentée ici. Le rendement le plus élevé provenait de tissus extraits avec tampon d’extraction de protéines tissulaires, suivi de DDM, CHAPS, ASB-14, et le rendement le plus faible de l’ACN et de l’AFE.
De façon constante, les protéines totales identifiées étaient également les plus élevées dans l’échantillon extrait tampon d’extraction de protéines tissulaires, et suivaient la même tendance que le rendement total. On voit ici la comparaison des profils de protéines électrophoresis gel d’une dimension de la SPCA, avant et après avoir été soumis aux étapes optimisées de préparation et de nettoyage de l’échantillon. Dans l’ensemble, un degré élevé de frottis et une mauvaise séparation des bandes protéiques ont été observés à la voie trois.
Ce profil démontre que les échantillons peuvent contenir un réaccente d’extraction, ainsi que des contaminants tels que les lipides et les débris cellulaires. Toutefois, les échantillons de la SPCA qui ont été séparés en supernatants et en granulés, puis soumis au protocole optimisé, ont donné lieu à des profils exemplaires d’électrophoresis gel unidimensionnel. La méthode optimisée pour l’extraction rapide, robuste et efficace des protéines à partir de microvessels oculaires peut également être facilement appliquée à d’autres échantillons à base de tissus.
On y voit des profils protéiques du supernatant et des granulés de cerveau murin et d’échantillons de tissus cardiaques. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de soumettre les échantillons pour compléter l’homogénéisation, de séparer le surnatant de la pastille, et d’enlever les contaminants et les réagenants d’extraction. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de l’ophtalmologie expérimentale et translationnelle pour explorer en profondeur le protéome de la vascularisation oculaire en utilisant les yeux porcins comme modèle.
