안구 시료의 포괄적인 프로테아메 분석을 위한 고품질 질량 분석-호환 시료의 제조는 건강과 질병에 연루된 분자 메커니즘 및 신호 경로를 해명하는 데 매우 중요합니다. 설명된 작업 흐름은 안구 마이크로 혈관과 같은 질량 제한 시료의 분석을 위해 특별히 수용된 엄격한 샘플 준비 단계에 대한 간단하면서도 견고한 접근법을 나타낸다. 연구의 주요 목적은 안구 혈관에 대한 MS 호환 방법론을 확립하는 것이지만, 설명된 작업 흐름은 다양한 세포 및 조직 기반 샘플에 광범위하게 적용될 수 있다.
일반적으로, 이 방법에 새로 온 개인은 선택된 짧은 후방 섬모 동맥 또는 SPCA 지점의 식별 및 격리가 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있다. 신선한 돼지 눈, 시신경 및 외래 조직과 함께, 즉시 사후 사후 지역 아바토이르에서 얻어졌다. 얼음차가운 크렙스-헨셀레이트 버퍼가 들어 있는 해부 챔버에 안구를 놓습니다.
조심스럽게 날카로운 마요 가위로 주변 근육과 조직을 잘라. 메스를 절개하고, 눈이 전방과 후방 반으로 분리 될 때까지 날카로운 마요 가위로 적도 평면을 따라 세계를 잘라. 표준 패턴 집게 한 쌍을 사용하여 눈의 후방 절반에서 가능한 한 많은 유리체 바디를 제거합니다.
해부 핀을 사용하여 주의 깊게 눈의 뒤쪽 절반을 고정한 후 시신경을 둘러싼 결합 조직을 부드럽게 잘라 학생 반나스 스프링 가위로 근본적인 레트로불 혈관을 노출시. 파라옵트와 단면 의 짧은 후방 섬모 동맥을 주변 결합 조직과 함께 5형 정밀 핀셋과 반나스 캡술절제술 가위를 분리합니다. 오염 물질과 혈액 잔류물을 제거하기 위해 얼음 차가운 PBS에서 고립 된 동맥을 헹구기 전에 여분의 미세 기울어진 핀셋과 가위를 사용하여 동맥 세그먼트에서 결합 조직을 부드럽게 제거합니다.
두 눈에서 동맥을 풀면 하나의 생물학적 복제를 얻은 다음 분석 균형을 사용하여 샘플을 계량합니다. 각 튜브에 0.5 및 1밀리미터 지르코늄 산화물 비드의 혼합물을 추가하고 조직 단백질 추출 시약이 있습니다. 이제 샘플 튜브를 블렌더 균질화제에 적재합니다.
타이머를 2분으로 설정하고 속도 레벨을 6으로 설정하고 균질화를 시작합니다. 실행 후 샘플을 확인하여 완전한 균질화를 위해 샘플을 확인하고 각 실행 사이에 얼음에 샘플을 유지합니다. 샘플이 완전히 균질화 될 때까지 주기를 반복합니다.
조심스럽게 파이펫 호모게를 신선한 미세 원심 분리기 튜브로 합니다. 원심 분리는 불용성 단백질을 펠릿에 섭씨 4도에서 20 분 동안 10, 000 배 G에서 샘플을 분리합니다. 펠릿 층을 건드리지 않고 수용성 단백질을 함유한 상체를 조심스럽게 피펫하고 신선한 미세 센트심분리기 튜브로 옮습니다.
추출 버퍼 2A 2A와 5 마이크로리터의 추출 버퍼 샘플을 각 펠릿 샘플에 추가합니다. 그런 다음 파이펫으로 펠릿을 여러 번 중단합니다. 초음파 균질화제를 사용하여 펠릿을 완전히 균질화하십시오.
진폭을 60으로 설정하고 사이클을 하나로 설정합니다. 작은 볼륨시 시료의 균질화에 적합한 티타늄으로 만든 프로브를 사용하십시오. 펠릿과 추출 버퍼 혼합물에 프로브를 얼음에 담그고 시작 버튼을 누릅니다.
펠릿 덩어리가 완전히 균질화 될 때까지 샘플을 초음파 처리하여 각 초음파 처리 사이에 몇 초 동안 일시 중지합니다. 시각적으로 완전한 균질화를 확인합니다. 동형모를 파이펫과 여러 번 섞어 덩어리가 없는지 확인합니다.
이 절차에 대해 3킬로달톤 차단장치가 있는 원심 필터 장치를 사용합니다. 3킬로달톤 컷오프 필터 유닛을 마이크로센심분리기 튜브에 삽입합니다. 파이프200 마이크로리터의 샘플 호머는 하나의 필터 장치에 균질화하고, 동일한 필터에 200 마이크로리터의 산화물을 추가합니다.
필터 장치를 단단히 캡핑한 후 필터 장치를 원심분리기에 넣고 섭씨 4도에서 15분 동안 14, 000회 G로 회전합니다. 원심분리 후, 시료 농축액을 함유한 필터 유닛을 여과물을 함유하는 마이크로원심분리기 튜브로부터 분리하여 여과를 폐기한다. 400 마이크로리터의 산화된 물을 필터 장치에 추가하여 농축물을 재구성한다.
세 번 여과를 반복 한 후, 조심스럽게 청소 된 샘플은 깨끗한 마이크로 튜브에 농축. 텍스트 프로토콜에 나열된 1차원 젤 전기전도에 대한 샘플을 준비하고 파이펫과 잘 섞습니다. 샘플을 70°C의 드라이 블록 히터에서 15분간 가열하고 실온으로 식힙니다.
파이펫을 사용하여 차선당 50 마이크로그램의 시료를 주의 깊게 적재하고, 프리스테인 단백질 표준을 분자 질량 마커로 적재합니다. 175볼트의 일정한 전압에서 약 60분 동안 젤을 실행합니다. 실행의 끝에서, 조심스럽게 젤 나이프를 사용하여 카세트 플레이트에서 젤을 제거하고 젤 염색 상자에 젤을 전송합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 젤의 고정 및 염색을 수행합니다. 염색 용액에 젤을 밤새 흔들어 최상의 전반적인 결과를 제공합니다. 스테인링 용액을 조심스럽게 데칭하고 200 밀리리터의 탈온된 물로 교체한 후, 물 속에서 적어도 7~8시간 동안 젤을 흔들어 배경을 지웁힙니까?
깨끗한 새로운 마이크로톤 블레이드로 젤의 단백질 밴드를 소비합니다. 밴드를 작은 조각으로 자르고 젤 조각을 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 조심스럽게 옮길 수 있습니다. 100밀리알라 암모늄 중탄산염과 아세토닐릴을 함유한 500마이크로리터를 첨가합니다.
샘플을 실온에서 30분 동안 배양하고 가끔 씩씩한 흔들림을 가합니다. 조심스럽게 스테킹 솔루션을 피펫. 잔류 얼룩이 있는 튜브를 시각적으로 확인하고 젤 조각이 여전히 파란색으로 얼룩진 경우 이 단계를 반복하십시오.
약 400 마이크로리터의 갓 준비된 DTT 용액을 추가하고 섭씨 56도에서 30분 동안 배양합니다. 파이펫으로 환원 용액을 폐기한 후, 약 400마이크로리터의 갓 준비된 IAA 용액을 추가하고 실온에서 30분 동안 어둠 속에서 배양합니다. 파이펫으로 알킬링 버퍼를 제거하고 폐기합니다.
젤 조각이 수축하고 불투명해질 때까지 실온에서 500 마이크로리터를 10-15분 동안 10-15분 간 추가합니다. 파이펫은 아세토닐트리어를 꺼내고, 젤 조각을 후드 아래에서 5~10분 동안 공기 건조시합니다. 그런 다음 각 튜브에 트립신 용액50 마이크로리터를 피펫하여 젤 조각을 완전히 덮고 튜브를 섭씨 4도에서 배양합니다.
30분 후, 필요한 경우 젤 조각을 완전히 덮을 충분한 트립신 버퍼를 추가합니다. 하룻밤 사이에 샘플을 섭씨 37도에서 배양합니다. 펩티드 추출을 수행하기 위해, 조심스럽게 튜브에서 추출 된 펩티드 용액을 파이펫하고 깨끗한 마이크로 튜브로 전달합니다.
원심 진공 증발기에서 상체를 건조시. 각 튜브에 100 마이크로리터의 추출 버퍼를 젤 조각으로 추가하고 흔들림으로 30 분 동안 배양하십시오. 피펫은 각각의 밴드에 따라 추출된 펩티드를 포함하는 동일한 마이크로튜브로 피펫하고 진공 원심분리기에서 건조시.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 펩티드 정제 및 액체 크로마토그래피-전기분무-이온화 MS/MS 분석을 진행한다. 각 유형의 세제로 추출된 샘플의 총 단백질 양은 여기에 묘사됩니다. 가장 높은 수율은 조직 단백질 추출 버퍼로 추출된 조직에서 나온 것이며, DDM, CHAPS, ASB-14, 그리고 ACN 및 TFA에서 가장 낮은 수율을 기록했습니다.
일관되게, 확인된 총 단백질은 또한 조직 단백질 추출 완충추출 샘플에서 가장 높았으며, 총 수율과 동일한 경향을 따랐다. 여기에 도시된 SPCA의 1차원 겔 전기전경 단백질 프로파일의 비교는 최적화된 시료 준비 및 세척 단계를 거치기 전과 후에 이다. 전반적으로, 단백질 밴드의 높은 수준의 번짐과 불량분리가 레인 3에서 관찰되었다.
이 프로파일은 시료에 추출 시약, 지질 및 세포 이물질과 같은 오염 물질을 포함할 수 있음을 보여줍니다. 그러나, SPCA 샘플은 상피및 펠릿으로 분리된 다음 최적화된 프로토콜을 실시한 후, 예시적인 1차원 겔 전기포고증 프로파일을 초래하였다. 안구 미세 혈관에서 신속하고 견고하며 효율적인 단백질 추출을 위한 최적화된 방법은 다른 조직 기반 샘플에도 쉽게 적용할 수 있습니다.
여기에 표시된 상류체의 단백질 프로파일과 뮤린 뇌 및 심장 조직 샘플의 펠릿이 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 균질화를 완료하기 위해 샘플을 피사체를 기억하는 것이 중요합니다, 펠릿에서 상류제를 분리하고, 오염 물질과 추출 시약을 제거하는. 개발 후, 이 기술은 실험 및 번역 안과 분야의 연구자들이 돼지 눈을 모델로 사용하여 안구 혈관의 프로테아움을 철저히 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
