Bu protokol, herhangi bir özel ekipman kullanmadan bir 3B hücre kültürü modelinin güvenilirliğini artırmak için basit bir yöntem kullanır. Bu tekniğin en büyük avantajı, kübik cihaz içindeki ilk kültür durumunu kontrol ederek tekrarlanabilir 3B kültür deneyi yapabilmemizdir. Beşe beş milimetrelik polikarbonat kübik çerçeve hazırladıktan sonra, çerçeveyi önceden soğutulmuş bir kaydırağa ve bir buz kutusuna yerleştirin ve kübik çerçevenin üst yüzeyinden önceden ısıtılmış 1,5%agarose 12 mikrolitre eklemek için bir pipet kullanın.
Düz bir yüzey elde etmek ve polimer tedavi etmek için izin agarose yayıldı. Çerçeveyi camın kenarına kaydırmak için cımbız kullanın ve çerçeveyi, çerçeveyi slayta geri yerleştirmeden önce açık tarafın aşağı bakacak şekilde döndürün. Çerçevenin sonraki iki yüzeyini daha agarose ile doldurduktan sonra, az önce gösterildiği gibi, agarose'u açık bir yüzden bir kap içine düşürerek dördüncü ve beşinci tarafta agarose bir duvar oluşturun.
Bir ilk hücre kümesi şekli kurmak için hibrid jel küp kültür alanı içine ilgi hücre kültürü için uygun bir hücre dışı matris enjekte ve küp üzerine bir fabrikasyon mikro kalıp ayarlayın. Sonra 37 santigrat derece 25 dakika boyunca bir karbondioksit kuluçka küpü yerleştirin. Hücre dışı matris tedavi edildiğinde, matrisin bozulmaması için mikro kalıbı dikkatlice kaldırın.
İstenilen kalıp şeklinde bir cep ekstrasellüler matris imal edilecektir. Hücreleri yüklemek için uygun deneysel hücre kültürü orta santrifüj sonra deneysel hücre süspansiyon konsantre ve ekstrasellüler matris içinde cebine hücreleri enjekte. 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca karbondioksit inkübatör içine küp yerleştirin hücrelerin hücre dışı matris cebine düşmesine izin vermek için, mikro kalıp tarafından oluşturulan alanı doldurarak.
Kuluçka sonunda, bir 24 kuyu plaka bir kuyu içine küp yerleştirin ve kuyuya uygun hücre kültürü orta 100 mikrolitre ekleyin. Cebi kapatmak için ekstra hücre dışı matris enjekte edin ve küpü 25 dakika boyunca kuvöze geri verin. Hücre dışı matriks tedavi edildiğinde yüzeyi kapatmak ve 37 santigrat derece 10 ila 20 dakika boyunca damla tedavi küp üst yüzeye yaklaşık 10 mikrolitre 20 santigrat damla.
Sonra küp içinde hücrelere beslenme transferini kolaylaştırmak için ozmotik basınç teşvik etmek için taze orta ile tüm küp kapağı. Çok yönlü gözlem ile noninvaziv 3D şekil tanıma için, bir mikroskop aşamasıüzerine plaka yerleştirin ve parlak alan veya faz kontrast mikroskobu ile küpher iki tarafında görüntüleri elde, yakalar arasında görüntülenecek küp hizmeti döndürmek için cımbız kullanarak. Çok yönlü gözlem ile immünofloresan görüntüleme için, ilk küp içeren kuyudan supernatant aspire ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit küp düzeltmek.
Fiksasyon sonunda, yıkama başına 10 dakika pbs ile iki kez küp yıkayın. Küpü %0,5 triton x-100 ve PBS ile 10 dakika boyunca dört santigrat derecede geçirgenleştirin. Daha sonra, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca keçi serumu ve immünofloresan tampon ile herhangi bir nonspesifik yapıştırma engellemeden önce, yıkama başına 10 dakika PBS üç kez küp yıkayın.
Daha sonra standart antikor boyama protokollerine göre uygun birincil antikor ile hücreleri lekeleyin. Daha sonra küpün altı tarafını lazer veya floresan mikroskobun üzerinde görüntüleyin. Bu temsili deneyde, normal insan bronşiyal epitel hücreleri ile kültürlendirilen melez jel küplerinin çok yönlü görüntülemesi, faz kontrastı ve kültürlerin immünororesan görüntülemesi ile ilk silindirik veya prizma şeklindeki hücre kültürünün oluşumunu göstermektedir.
Burada normal insan epitel hücrelerinin immün boyanması başlangıçta hibrid jel küp silindirik bir şekle kontrol, bronşiyal ağaç nesil sonra gösterilir. Dallar silindirik eksene dik gösterir, çok boyutlu görüntüleme ile ortaya. Hücre dışı matris cebine yüksek yoğunlukta hücre enjekte etmek önemlidir, çünkü hücrelerin düşük yoğunluğu kuluçkadan sonra hücre kalitesinin bozulmasına neden olabilir.
Bu yöntem deseni, çanak geliştirme mekanizmasını incelemek için çok yönlü görüntüleme ile nicel ölçüm ile 3Boyutlu hücresel desenin tekrarlanabilir oluşumudur.
