Bu protokol, yüksek içerik tarama uygulamaları için insan pluripotent kök hücre kaynaklı nöronların kullanımını kolaylaştırır. Özellikle iyi sinaps lar, insan nöronlar uzun kültür dönemleri gerektiren atama kiçin uygundur. Büyük formatlı yemeklerden HCS uyumlu çoklu kuyulara kadar nöronların canlılığını koruyacak şekilde yeniden kaplamasını gösteriyoruz.
Sezgilere karşı, proteaz kuluçkasını yeniden sulandırma ve rekaplamadan önce uzatmanın nöronal sağkalımı artırdığını gösteriyoruz. İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlar giderek temel araştırma, ilaç geliştirme ve dejeneratif tıp alanlarında ilgili. Bu nazik titrasyon yöntemi, kalın bir işlem ağına sahip büyük tek hücre tabakasını yeniden askıya almak için kullanılabilir.
İnsan iPSC'lerine ek olarak, birincil nöronların kültürünü yeniden kaplamak veya onları sıralama veya tek hücre dizilimi için yeniden askıya almak için kullanılabilir. Protokol adımlarını dikkatle takip etmek ve nöronların plakadan ayrılmasını sık sık izlemek önemlidir. En uygun kuluçka süresi kültüre bağlı olarak değişebilir.
Görsel gösteri bile deneyimsiz araştırmacılar bu prosedürü çoğaltmak için sağlar. PBS ile farklılaştırılmış nöronların plakasını hafifçe durulayarak başlayın. PBS'yi plakanın duvarından aşağı yayılTın ve bozulmaması için doğrudan hücrelere dağıtmayın.
PBS'yi çanak kenarından aspire ederken, hücrelere dokunmamaya özen gösterilsin. 10 santimetrelik plaka başına en az bir mililitre proteolitik enzim uygulayın. Ve hücreleri 40-45 dakika boyunca kuvöze geri verin.
Kuluçka sırasında, fazlı kontrast mikroskop üzerinde nöronlar kontrol edin ve nöral ağ tamamen plaka ayırır ve parçalanmaya başlayana kadar proteaz tedaviye devam edin. Nöronlar ayrıldığında, proteaz her bir mililitre için taze DEMEM medya beş mililitre ekleyerek sindirim durdurmak. Hücreleri plakaya karşı beş ila sekiz kez hafifçe titreetmek için serolojik pipet kullanın ve çok fazla basınç uygulamadığından emin olun.
Hücreleri 100 mikrometrelik bir kafesten 50 mililitrelik konik bir tüpe doğru süzün. Ve taze DMEM medya ek beş mililitre ile süzgeç durula. Hücreleri 1000 kez G'de beş dakika boyunca aşağı döndürmek için bir tezgah üstü santrifüj kullanın.
Santrifüjden sonra konik tüpü biyogüvenlik kabinine geri döndürün ve ortamların çoğunu aspire edin, hücreleri nemli tutmak için 250 mikrolitre bırakın. İki mililitre taze DMEM medyasındaki hücreleri yavaşça yeniden askıya alın ve beş mililitrelik serolojik pipetin ucundan geçirin. Son olarak, tüpü 2-3 kez ters çevirin.
Canlı hücreleri saymak için hemositometre ve tripan mavikullanın. Ve sonra DMEM istenilen konsantrasyona. Belirli hücre hattının gereksinimlerine bağlı olarak, tüp için uygun takviyeleri ekleyin ve yavaşça konik tüp 2-3 kez yatırarak hücreleri karıştırın.
24 kuyulu bir plakadan aspire laminin kaplama ve pbs ile bir kez durulayın. PBS'yi aspire edin. Ve kümelenmeyi önlemek için sekiz şeklindeki her kuyuya hücre çözeltisi uygulayın.
Hücreleri kaplama bittiğinde, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit olarak belirlenen kuvöz plaka dönmek. Kısaca erken hücre ölümü muhabiri stok çözüm girdap ve el yazması talimatlarına göre kuyulara ekleyin. 20 dakika bekleyin.
Ve sonra cam alt çok kuyularda canlı ve ölü hücreleri görüntü. Proteaz kuluçka uzatılması hücrelerin kaldırılan levha içinde nöronal ağ gevşeme sağlar. Bu da dissosiyasyon sırasında hücre ölümünün azalmasına ve sonraki günlerde daha verimli bir iyileşmeyle sonuçlanır.
Genişletilmiş enzim kuluçka prosedürü kullanarak, kültürler replating ve ölü veya ölmekte olan hücrelerin daha düşük yoğunluğu sonra gün boyunca hücre canlılığı yaklaşık iki katına sergiler. Nöronal farklılaşmageçiş aşaması birkaç gün içinde gerçekleşir, sırasında hücreler yavaş yavaş geç evre nöronal belirteçleri ifade. Bu belirteçler, dört haftalık ön farklılaşmadan sonra yeniden doldurulan kültürlerde hemen tespit edilir.
Genişletilmiş proteaz protokolü de orta neuride büyüme artırır. Hem total neurit uzunluğu hem de dendrit büyümesi iyileşir. Replating de sinapslar çalışma için yararlıdır.
Rekaplamadan sadece bir hafta sonra sinaptik öncesi ve sonrası proteinler için belirteçler gözlendi. Ayrıca, spontan depolarizasyon ve sinaptically tahrikli akımlar elektriksel aktivite kalsiyum görüntüleme veya multielektrot dizileri kullanılarak tespit edilebilir. Bu kaplama yordamı birçok uygulama türüne uyarlanabilir.
Potansiyel terapötik bileşikleri belirlemek için yüksek içerik tarama ek olarak, görüntüleme büyüme konileri veya multielektrot dizi kayıtları için kullanılabilir. Zaten uzun süreçler oluşturmuş nöronların mekanik dissosiyasyonu stresli. Uzatılmış enzimatik kuluçka ve hücrelerin nazik titrasyonu bu işlemin başarısı için gerekli adımlardır.
