이 프로토콜은 고함량 스크리닝 애플리케이션을 위한 인간 만능 줄기 세포 유래 뉴런의 사용을 용이하게 합니다. 그것은 특히 잘 시 냅 스를 사화에 적합, 인간의 뉴런에서 긴 문화 기간을 필요로 하는. 우리는 그들의 생존력을 보존하는 방식으로 HCS 호환 멀티 웰에 큰 형식의 요리에서 뉴런의 변환을 보여줍니다.
반대로, 우리는 재중단 및 투약 수율을 재현하기 전에 프로테아제 잠복을 연장하면 뉴런 생존이 향상되어 있음을 보여줍니다. 인간 만능 줄기 세포 유래 뉴런은 기본 연구, 약물 개발 및 퇴행성 의학 분야에서 점점 더 관련이 있습니다. 이 부드러운 적정 방법은 프로세스의 두꺼운 네트워크를 갖는 세포의 큰 단층을 재일시 중단하는 데 사용할 수 있습니다.
인간 iPSC 이외에, 그것은 1 차적인 뉴런의 문화를 재플레이트하거나 사실 정렬 또는 단하나 세포 순서를 위해 그(것)들을 재중단하는 것을 이용될 수 있습니다. 프로토콜 단계를 신중하게 따르고 자주 플레이트에서 뉴런의 프로테아제 매개 분리를 모니터링하는 것이 중요합니다. 최적의 잠복기 시간은 문화에 따라 다를 수 있습니다.
시각적 데모를 사용하면 경험이 부족한 조사자도 이 절차를 재현할 수 있습니다. PBS로 분화 된 뉴런의 플레이트를 부드럽게 헹구는 것으로 시작합니다. 접시의 벽 아래로 PBS를 분산 하 고 그들을 방해 하지 않도록 세포에 직접 하지.
접시 가장자리에서 PBS를 흡입하면서 세포를 만지지 않도록주의하십시오. 10센티미터 플레이트당 적어도 1밀리리터의 촉매 효소를 바르는다. 그리고 세포를 인큐베이터로 40~45분 동안 되돌려 보입니다.
인큐베이션 도중, 단계적 대비 현미경에 뉴런을 확인하고 신경망이 완전히 접시에서 분리하고 분해하기 시작할 때까지 protease 처리를 계속합니다. 뉴런이 분리되면 프로테아제 1밀리리터당 신선한 DEMEM 미디어 5밀리리터를 추가하여 소화를 중단하십시오. 세로지학적 파이펫을 사용하여 5~8번 플레이트에 세포를 부드럽게 적시하여 너무 많은 압력을 가하지 않도록 하십시오.
100 마이크로미터 메쉬를 통해 세포를 50 밀리리터 원내 튜브로 변형시켜 떨어뜨리십시오. 그리고 신선한 DMEM 미디어의 추가 5 밀리리터와 스트레이너를 헹지. 벤치 탑 원심분리기를 사용하여 5분 동안 1000배 G로 셀을 회전시합니다.
원심 분리 후, 원심 관을 생물 안전 캐비닛에 반환하고 대부분의 미디어를 흡습하여 250 마이크로 리터를 남기고 세포를 촉촉하게 유지하십시오. 신선한 DMEM 매체의 2밀리리터에서 세포를 부드럽게 재연한 다음 5밀리리터 세로지피트의 끝을 통과합니다. 마지막으로 튜브를 2~3번 반전시다.
헤모세포계와 삼중파를 사용하여 실행 가능한 세포를 계산합니다. 그리고 원하는 농도에 DMEM. 특정 세포주 요구 사항에 따라 튜브에 적절한 보충제를 추가하고 원문 튜브를 2 ~ 3 번 기울여 세포를 부드럽게 혼합하십시오.
24웰 플레이트에서 라미닌 코팅을 흡인하고 PBS로 한 번 헹구세요. PBS를 흡인합니다. 그리고 응집하지 않도록 도면 8 모션으로 각 웰에 셀 용액을 적용합니다.
세포를 도금이 완료되면 플레이트를 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%로 설정된 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 초기 세포 사멸 기자의 주식 용액을 간략하게 소용돌이치며 원고 의 지시에 따라 우물에 추가하십시오. 20분 간 기다립니다.
그리고 유리 바닥 멀티 웰에 라이브 및 죽은 세포를 이미지. 프로테아제 잠복을 연장하면 세포의 해제 된 시트 내에서 신경 망을 느슨하게 할 수 있습니다. 이것은 해리의 시간에 감소된 세포 죽음 결과 뿐만 아니라 다음 일 동안 더 효율적인 복구 결과.
확장된 효소 인큐베이션 절차를 사용하여, 배양은 세포 생존가능성의 대략적인 두 배로 나타낸 후 며칠 동안 세포 생존력과 죽거나 죽어가는 세포의 낮은 밀도를 나타낸다. 신경 분화의 전이 단계는 세포가 점차적으로 후기 신경 마커를 표현하는 동안 며칠 에 걸쳐 일어난다. 이러한 마커는 4주 간의 사전 분화 후 보충된 배양에서 즉시 검출된다.
확장된 프로테아제 프로토콜은 또한 중성구 아웃성장을 적당히 향상시킵니다. 총 중성구 길이와 수상월화 증가가 모두 개선됩니다. Replating은 시냅스를 공부하는 데에도 유용합니다.
상대 화 후 불과 1 주일, 사전 및 시 냅 스 후 단백질에 대 한 마커 관찰 되었다. 더욱이, 자발적인 탈극화 및 합성 중심 전류로부터의 전기 활동은 칼슘 이미징 또는 다중 전극 어레이를 사용하여 검출할 수 있다. 이 상대화 절차는 여러 유형의 응용 프로그램에 맞게 조정할 수 있습니다.
잠재적인 치료 화합물을 식별 하기 위해 높은 콘텐츠 스크리닝 이외에, 그것은 이미징 성장 콘 또는 다중 전자 배열 기록에 사용할 수 있습니다. 이미 긴 과정을 형성 한 뉴런의 기계적 해리는 스트레스입니다. 길쭉한 효소 배양과 세포의 부드러운 적정은 이 절차의 성공을 위한 필수적인 단계입니다.
