このプロトコルは、高コンテンツスクリーニングアプリケーションのためのヒト多能性幹細胞由来ニューロンの使用を促進する。これは、シナプスをアッシングするために特に適しています, 人間のニューロンでは、長い培養期間を必要とします.我々は、その生存率を維持する方法で、大判皿からHCS適合のマルチウェルへのニューロンの再めっきを実証する。
直観的に、再懸濁・再めっきする前にプロテアーゼインキュベーションを拡張すると、ニューロンの生存率が向上することを示す。ヒト多能性幹細胞由来ニューロンは、基礎研究、医薬品開発、変性医療の分野でますます関連性が高まっています。この穏やかな滴定法は、プロセスの厚いネットワークを有する細胞の任意の大きな単層を再中断するために使用することができる。
ヒトiPSCに加えて、一次ニューロンの培養を再プレートしたり、ファクトソートや単一細胞シーケンシングのために再中断したりするために使用できます。プロトコルのステップを注意深く実行し、頻繁にプレートからニューロンの分離を媒介プロテアーゼを監視することが重要です。最適なインキュベーション時間は、培養によって異なる場合があります。
視覚的なデモンストレーションでは、経験の浅い調査員でもこの手順を再現できます。PBSで分化したニューロンのプレートをそっとすすめることから始めます。PBSをプレートの壁に分散させ、細胞に直接分散させ、それらを破壊しないようにします。
皿の端からPBSを吸引しながら、細胞に触れないように注意してください。10センチメートルプレートあたり少なくとも1ミリリットルのタンパク質分解酵素を塗布する。そして、40〜45分間培養器に細胞を戻す。
インキュベーション中に、段階的なコントラスト顕微鏡でニューロンをチェックし、ニューラルネットワークがプレートから完全に切り離されて分解し始めるまでプロテアーゼ処理を続けます。ニューロンが切り離されたら、プロテアーゼの1ミリリットルごとに新鮮なDEMEM培地を5ミリリットル加えることによって消化を止める。血清ピペットを使用して、細胞をプレートに対して5〜8回穏やかに拍子にし、圧力をかけすぎないようにします。
100マイクロメートルのメッシュを通して細胞を50ミリリットルの円錐形チューブにひずみ、滴下します。そして、新鮮なDMEMメディアの追加の5ミリリットルでストレーナーをすすいでください。ベンチトップの遠心分離機を使用して、細胞をGの1000倍に5分間回転させます。
遠心分離後、円錐管をバイオセーフティキャビネットに戻し、ほとんどの媒体を吸引し、細胞を湿らせたまま250マイクロリットルを残します。新鮮なDMEM培地の2ミリリットルで細胞を穏やかに再懸濁し、5ミリリットルの血清ピペットの端を通過します。最後に、チューブを2〜3回反転します。
生細胞を数えるためにヘモサイトメーターと三重青を使用してください。そして、所望の濃度にDMEM。特定の細胞株の要件に応じて、チューブに適切なサプリメントを追加し、コニカルチューブを2〜3回傾けることによって細胞を穏やかに混合します。
24ウェルプレートからラミニンコーティングを吸い上げ、PBSで一度すすいます。PBSを吸引する。そして、束を避けるために図8の動きの各井戸に細胞溶液を適用する。
細胞のめっきを終えたら、37°Cと5%の二酸化炭素に設定されたインキュベーターにプレートを戻します。初期細胞死レポーターのストックソリューションを簡単に渦液し、原稿の指示に従って井戸に追加します。20 分待ちます。
そして、ガラス底のマルチウェル上の生きている細胞と死んだ細胞をイメージします。プロテアーゼインキュベーションを延長すると、細胞の持ち上げられたシート内の神経ネットワークの緩みが可能になります。これは解離時に減少した細胞死をもたらすだけでなく、次の日にわたってより効率的な回復をもたらす。
拡張酵素インキュベーション手順を用いて、再めっき後の日における細胞生存率のおよその倍増と死細胞または死死細胞の密度の低下を示す。ニューロン分化の移行期は数日にわたって行われ、その間に細胞は徐々に後期のニューロンマーカーを発現する。これらのマーカーは、4週間の事前分化後に再入植された培養物で直ちに検出される。
拡張プロテアーゼプロトコルはまた、中程度に神経化物の伸びを増強する。全中性の長さと樹状突起の両方が改善される。再めっきはシナプスの研究にも役立ちます。
再めっきのわずか1週間後に、シナプス前およびシナプス後のタンパク質のマーカーが観察された。また、自発的な脱分極と相乗的に駆動される電流からの電気的活動は、カルシウムイメージングや多電極アレイを用いて検出可能である。この再めっき手順は、多くの種類の用途に適応することができる。
潜在的な治療化合物を同定するための高含有スクリーニングに加えて、イメージング成長コーンまたは多電極アレイ記録に使用することができる。すでに長いプロセスを形成しているニューロンの機械的解離はストレスです。細長い酵素インキュベーションと細胞の穏やかな滴定は、この手順の成功に不可欠なステップです。
