Este protocolo facilita o uso de neurônios pluripotentes humanos derivados de células-tronco para aplicações de triagem de alto conteúdo. É particularmente adequado para avaliar sinapses, que em neurônios humanos requerem longos períodos de cultura. Demonstramos a replação de neurônios de pratos de grande formato em multi-poços compatíveis com HCS de forma a preservar sua viabilidade.
Contra-intuitivamente, mostramos que estender a incubação de protease antes de resuscupar e replacar produz melhor sobrevida neuronal. Os neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanos são cada vez mais relevantes nas áreas de pesquisa básica, desenvolvimento de medicamentos e medicina degenerativa. Este método de titulação suave pode ser usado para resuspensar qualquer grande mono-camada de células com uma rede espessa de processos.
Além dos iPSCs humanos, ele pode ser usado para repelar a cultura dos neurônios primários ou para resuspensá-los para classificação de fato ou sequenciamento de células únicas. É importante seguir os protocolos com cuidado e frequência monitorar o destacamento mediado protease dos neurônios da placa. O tempo ideal de incubação pode variar, dependendo da cultura.
A demonstração visual permite que até mesmo investigadores inexperientes reproduzam esse procedimento. Comece enxaguando suavemente a placa de neurônios diferenciados com PBS. Disperse o PBS pela parede da placa e não diretamente nas células para evitar interrompê-los.
Aspire o PBS da borda do prato enquanto o derruba, tomando cuidado para não tocar nas células. Aplique pelo menos um mililitro de enzima proteolítica por placa de 10 centímetros. E devolva as células à incubadora por 40 a 45 minutos.
Durante a incubação, verifique os neurônios em um microscópio de contraste em fases e continue o tratamento de protease até que a rede neural se desprende completamente da placa e comece a se quebrar. Quando os neurônios se separarem, parem a digestão adicionando cinco mililitros de mídia DEMEM fresca para cada mililitro de protease. Use uma pipeta sorológica para titular suavemente as células contra a placa cinco a oito vezes, certificando-se de não aplicar muita pressão.
Coe as células através de uma malha de 100 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros, gota a gota. E enxágue o coador com mais cinco mililitros de mídia DMEM fresca. Use uma centrífuga de bancada para girar as células a 1000 vezes G durante cinco minutos.
Após a centrifugação, devolva o tubo cônico ao armário de biossegurança e aspire a maior parte da mídia, deixando 250 microliters para manter as células úmidas. Levemente resuspenque as células em dois mililitros de mídia DMEM fresca e passe-as através do final de uma pipeta sorológica de cinco mililitros. Finalmente, inverta o tubo duas a três vezes.
Use um hemótmetro e azul tripano para contar as células viáveis. E então DMEM para a concentração desejada. Adicione suplementos apropriados ao tubo, dependendo dos requisitos da linha celular específica e misture suavemente as células inclinando o tubo cônico duas a três vezes.
Aspirar revestimento de laminina a partir de uma placa de 24 poços e enxágüe-o uma vez com PBS. Aspire a PBS. E aplique solução celular a cada poço em um movimento de figura oito para evitar a aglomeração.
Quando terminar de emplacar as células, devolva a placa à incubadora fixada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Brevemente vórtice a solução de estoque do repórter de morte celular precoce e adicioná-lo aos poços de acordo com as instruções do manuscrito. Espere 20 minutos.
E então imagem as células vivas e mortas em vários poços de fundo de vidro. Prolongar a incubação protease permite o afrouxamento da rede neuronal dentro da folha levantada das células. Isso resulta em redução da morte celular no momento da dissociação, bem como resulta em uma recuperação mais eficiente nos dias seguintes.
Usando o procedimento de incubação de enzimas estendida, as culturas exibem uma duplicação aproximada da viabilidade celular durante os dias após a replação e uma menor densidade de células mortas ou moribundas. A fase de transição da diferenciação neuronal ocorre ao longo de vários dias, durante a qual as células gradualmente expressam marcadores neuronais em estágio final. Esses marcadores são imediatamente detectados em culturas que foram repartidas após quatro semanas de pré-diferenciação.
O protocolo de protease estendido também melhora moderadamente o crescimento do neuride. Tanto o comprimento total do neuride quanto o crescimento do dendrite são melhorados. Replaing também é útil para estudar sinapses.
Apenas uma semana após a replação, foram observados marcadores para proteínas pré e pós-sináptica. Além disso, a atividade elétrica a partir da despolarização espontânea e correntes sináticas é detectável usando imagens de cálcio ou matrizes multieletrínos. Este procedimento de replação pode ser adaptado a muitos tipos de aplicações.
Além da triagem de alto conteúdo para identificar potenciais compostos terapêuticos, ele poderia ser usado para cones de crescimento de imagens ou gravações de matriz multieletrística. A dissociação mecânica de neurônios que já formaram processos longos é estressante. A incubação enzimática alongada e a titulação suave das células são passos essenciais para o sucesso deste procedimento.
