Bu prosedürün genel amacı, potasyum klorür veya ATP uyaranlarına dayalı nöronal veya glia yanıtlarını ayırt etmek için canlı hücrelerdeki sitozolik kalsiyum konsantrasyonlarındaki değişiklikleri izlemektir. Kalsiyum, nörotransmisyon, plastisite ve apoptoz dahil olmak üzere çeşitli hücresel süreçlerde yer alan önemli bir ikinci habercidir. Daha iyi floresan mikroskopların ve hesaplama yöntemlerinin geliştirilmesiyle ilişkili olan Fura-2 gibi yüksek seçici floresan kalsiyum boyasının ortaya çıkışı, canlı hücreler ve organizmalar üzerindeki görüntü kalsiyum sinyallemesine yüksek derecede uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip yüksek çözünürlüklü optik veriler sağlamıştır.
Bu protokol zenginleştirilmiş nöron, saflaştırılmış glia veya karışık popülasyon kültürlerine uyarlanabilir. Hangi hücre tiplerinin potasyum klorür ve ATP'ye diferansiyel tepkiye dayanarak uyaranları belirlemeye yanıt verdiğini izler. Potasyum klorür hücrenin membran potansiyelini değiştirir.
Ve bu, esas olarak nöronlar tarafından ifade edilen voltaj kapılı kalsiyum kanallarını açar. Öte yandan, ATP, esas olarak glial hücrelerde bulunan P2X7 büyük parça kanalını aktive eder. Potasyum klorür ve ATP uyaranlarını diğer ilaçlarla birleştirerek, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun artmasına bağlı olarak sinir sisteminin hangi bölmesinin bunlara yanıt verdiğini görmek mümkündür.
Bu prosedür için bazı cerrahi aletlere veya cımbızlara ihtiyacınız olacak. Bir biyogüvenlik kabini kullanın ve kontaminasyonu önlemek için en iyi uygulamaları gerçekleştirin. Tavuk retina kültürünü başlatmak için, hava hücresinin bulunduğu alttan döllenmiş bir yumurtayı dikkatlice açın.
İçeriği bir Petri kabına çıkarın ve bir çift cımbızla kafasını keserek embriyo donasyonuna devam edin. Kafa çıkarıldıktan sonra, temiz bir Petri kabına getirin ve ona biraz kalsiyum ve magnezyum içermeyen çözelti ekleyin. Daha sonra, bu süreçte onlara zarar vermemeye özen göstererek gözleri çıkarın.
Gözü CMF çözeltisi içeren başka bir Petri kabına getirin. Bir çift cımbızla, lensi çıkararak gözü parçalamaya başlayın. Daha sonra, lensin bıraktığı delikten başlayarak, gözde üç veya dört uzunlamasına kesik yapın.
Şeffaf vitreus gövdesini dikkatli bir şekilde çıkarın. Retinanın ona bağlı olmadığından emin olun. Daha sonra, retinayı pigmentli epitelden yavaşça ayırın.
Kalan epitel dokusunu çıkarın. Retina tamamen berrak olduğunda, küçük parçalar halinde kesin. Otomatik pipet yardımıyla tüm retina dokusunu alın.
Tüm CMF'yi çıkarmak için retinayı kısaca santrifüj edin. 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin. Ve dokuyu 10 dakika boyunca 37 C'de inkübe edin.
%10 fetal buzağı serumu içeren 1 mL ortam ekleyerek tripsin reaksiyonunu durdurun. Tüm tripsini çıkarmak için retinayı santrifüj edin. Hücreleri% 10 FCS içeren bir ortamla iki veya üç kez yıkayın.
Daha sonra, retina başına 2 mL orta ekleyin ve yavaşça mekanik olarak ayırın. Hücreleri seyreltin, böylece bir hemositometre ile düzgün bir şekilde sayabilirsiniz. Hücre yapışmasına yardımcı olmak için poli-L-lizin ve laminin ile korunan 15 mm'lik kapak kapakları kullanın.
Her bir kapak kapağında seyreltilmiş hücrelerinizin 50 L'lik pipeti. Hücreleri% 5 CO2 atmosferinde 37 C'de inkübe edin. Ve camı takmak için onları soğutun.
Bu yaklaşık bir ila iki saat sürmelidir. 1 mL ortam ekleyin ve deney gününe kadar inkübatöre geri koyun. Gerekirse, ortamın yarısını her iki ila üç günde bir değiştirin.
50 L DMSO ile 50 g'lık bir Fura-2 şişesini yeniden oluşturun. Krebs çözeltisi, deney sırasında hücreleri aktarmak için iyi bir seçenektir, çünkü floresan ölçümüne müdahale etmez. Başlamadan önce çözeltiyi önceden 37'ye ısıtın.
Poloxamer 407'yi ekleyin. Fura-2 ve DMSO ekleyin. Bir su banyosunda yedi dakika boyunca sonikleştirin.
Üç kuyucuğa Krebs çözeltisi ve bir başkasında çalışan Fura-2 çözeltisi ekleyerek 6 delikli bir plaka hazırlayın. Fura-2 kuyusuna eklemeden önce hücrelerinizi içeren kapak kapağını üç kez yıkayın. Hücreleri karanlık bir inkübatörde 30 dakika boyunca 37 C ve% 5 CO2 atmosferinde inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, üç kez tekrar yıkayın. Krebs içeren başka bir alıcıya aktarın ve ışıktan koruyun. Hazırlanan Fura-2'yi, hücrelerle daha fazla örtü slipini inkübe etmek için yeniden kullanmak mümkündür.
Çözelti sızıntısını önlemek için her çalıştırmadan önce kapak kaydırma desteğine ve haznesine silikon ekleyin. Krebs çözeltisinden kapak kapağını çıkarın ve mikroskop merceğinde tuz kristalleşmesini önlemek için tabanı damıtılmış suyla dikkatlice yıkayın. Kapak fişini desteğin üzerine koyun, kenarlıklara dikkatle bastırın.
Kapak kaydırma desteğini ve odacığı mikroskopa takın ve hücreleri Krebs çözeltisi ile perfüze etmeye başlayın. Uygun hücreleri seçin ve iyi bir alan seçin. Farklı morfolojilerine göre hücre gövdelerini seçerek ilgilenilen bölgeleri manuel olarak belirleyin.
Kalsiyum konsantrasyonunun varyasyonları, 340 ve 380 nm'de alternatif uyarılmayı takiben 510 nm'de yayılan floresan oranını ölçerek değerlendirildi. Potasyum klorür eklendikten sonra, birçok hücrenin parladığını ve floresan tepkisinin grafikte yükseldiğini görmek mümkündür. Potasyum klorür, esas olarak nöronlarda bulunan voltaj kapılı kalsiyum kanallarını açar.
Grafikteki her bir çizgi, benzersiz ilgi alanını temsil eder. Bu nedenle, deney sırasında bireysel hücre tepkilerini izlemek mümkündür. ATP uyaranları, esas olarak glial hücreler tarafından eksprese edilen P2X7 reseptörünü açar.
Bu zenginleştirilmiş bir nöron kültürüdür. Bu nedenle, burada birkaç glial hücre vardır. Bu kadar az hücrenin ATP uyaranlarına yanıt vermesinin nedeni budur.
Elde edilen değerler Metafluor yazılımı kullanılarak işlendi. Deneysel sonuçlar, her satırın tek bir hücreyi ve her satırın bir zaman noktasını temsil ettiği bir Excel tablosunda ifade edilir. Excel yazılımını kullanarak, tek tek hücrelerin kalsiyum varyasyonlarını ayrı ayrı veya hepsinin aynı grafikte çizmek mümkündür.
Herhangi bir uyarana reaktif hücrelerin miktarını ölçmek için,% 30'luk bir artış kalsiyum bazal seviyelerini artırın. Burada, 50 mm potasyum klorür ve 1 mm ATP uyaranları aldıktan sonra, nöronların ve glia'nın kalsiyum kaymaları açısından nasıl sinyal verdiğini araştırmak için embriyonik gün 8 civcivlerinden kültürdeki retina hücrelerini kullanıyoruz. Her deneyde, yaklaşık 100 hücre kolayca analiz edildi.
Şekil A, bir hafta boyunca muhafaza edilen hem nöronları hem de glia'yı içeren karışık bir kültürü temsil eder. Yanıtları ölçtüğümüzde, analiz edilen hücrelerin yaklaşık yarısının potasyum klorüre cevap verdiğini ve diğer yarısının ATP'ye cevap verdiğini görmek mümkündür. Şekil B, nöron bakımından zenginleştirilmiş bir kültürü ifade eder.
Sadece üç gün boyunca inkübe edildi, bu nedenle çoğu glial hücre henüz farklılaşmadı. Bu durumda, hücrelerin% 89'u potasyum klorüre cevap verir ve nöronların prevalansını güçlendirir. Şekil C, saflaştırılmış bir glia kültürünü göstermektedir.
Bu hücreler her üç günde bir orta değişikliklerle 10 gün boyunca muhafaza edildi. Bu süreden sonra çoğu nöron ölür ve sadece glia bırakır. Aslında, bu kültür yalnızca ATP tarafından aktive edildi.
Bu metodoloji, kalsiyumun ikinci bir haberci olarak evrensel özellikleri nedeniyle yaygın olarak kullanılmıştır. Fenotipik analiz, bu metodolojiyi kalsiyum görüntülemeden sonra sabit hücrelerin immünokimyası ile tamamlayarak geliştirilebilir. Bu protokol, diğer kalsiyum kanallarını ifade eden diğer karışık hücre sistemlerine de uyarlanabilir.
Önemli ipucu, fenotipik ifadeleriyle ilişkili farklı hücre tiplerinin seçici yanıtlarını bulmaktır.
