HIV-1 Aiken laboratuvar uncoating çalışmalar NIH hibe AI40364 AI50423 ve AI076121 tarafından desteklenmiştir. P24 ELISA kullanılan reaktifler de dahil olmak üzere birçok önemli malzemeler, NIH AIDS Araştırma ve Referans Programı, AIDS Bölümü, NIAID, NIH tarafından verilmiştir.

1. HIV-1 parçacıkların üretimi Devam etmeden önce, izin almak gerekir ve bulaşıcı HIV için onaylanmış bir biyogüvenlik tesisinde çalışmak üzere kurum Biyogüvenlik ofis yönergeleri izleyin. Bunu uygun bakım sağlamak ve biyogüvenlik laboratuar çalışma sırasında güvenlik önlemleri takip edilmektedir. HIV-1 parçacıkların üretimi genellikle kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi 7, 8 ile HIV-1 proviral DNA ile 293T hücrelerinde geçici transfeksiyon tarafından yapılır. Bulaşmış T hücrelerinin kültürü ile yetişen yüksek titresi virüs hisse senetleri de uygundur. <ol><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve antibiyotik ile desteklenmiş içeren Dulbecco&#39;nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) Kültür 293T hücreleri [Penisilin (100 IU / ml) ve Streptomisin (100 mg / ml)] 37 ° C,% 5 CO 2 . </li><li> % 0.25 &#39;lik tripsin-EDTA ve tohum 2x10 6 kullanarak yaklaşık konfluent yemekleri hücreleri Ayır </stransfeksiyon önce 100 mm kültür kaplarına başına 9 ml&gt; hücrelerinin bir gün. Virionlar üretimi için tohum altı 100 mm kültür kaplarına. Çekirdek konsantre hazırlık gerekiyorsa, daha fazla yemekler transfeksiyon numaralı seribaşı olabilir. </li><li> Ertesi gün, hücre mono tabakaları yaklaşık% 25 konfluent ve transfeksiyon için hazır olmalıdır. Transfekte hücreleri altı yemekleri için, 2.7 ml steril su ile hacmi 120 mikrogram proviral DNA getirmek. Bu karışımı 0.3 ml 2.5 M CaCl 2 ve 2XBBS 3 ml ekleyin ve birkaç kez aşağı yukarı pipetleme düzgün karıştırın. Karışımı 10-20 dakika oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Karıştırmak için hafifçe dönen her yemeğin merkezine çıkan karışımı damla damla 1 ml ekleyin. Inkübatör 35 ° C ve% 3 CO 2 set gecede yemekler (~ 16 saat) yerleştirin. </li><li> Kültür ortamı aspire edin ve hafifçe 5 ml PBS ekleyin. </li><li> PBS aspire edin ve 5 ml taze orta ekleyin. 37 ve inkübatörde Kültür hücrelerideg C ve% 5 ek 24-48 saat için 2 CO. </li><li> Viral parçacıkların bulunduğu kültür süpernatant toplayın, 50 ml konik santrifüj tüpüne aktarın. Tüm yemekler süpernatantlar birleştirin ve pelet hücreleri ve enkaz 5 dakika boyunca 1.500 xg&#39;de santrifüj. 0.45 mikron gözenek boyutu şırınga filtreleri kullanarak süpernatantı Filtresi. Önlemler canlı virüs ile çalışırken aerosol oluşumunu en aza indirmek için önlemler alınmalıdır. Bu santrifüj basamağı sırasında O-ring veya rotor kova kapakları ile konik tüplerin kullanımını içerir. Bu mümkün değilse, tüpler, vidalı kapakları parafilm ile sarılmalıdır. </li></ol> 2. HIV-1 virionlar Ultrasantrifügasyon konsantrasyonu <ol><li> Kültür süpernatant 38.5 ml polyallomer santrifüj tüpüne (Beckman SW32Ti rotor veya eşdeğeri) (30 ml) koyun. 5 ml, 5 ml pipetlemeyin kullanarak PBS içinde% 20 sukroz solüsyonu ile virüs içeren süpernatant hafifçe altında yatan. </li><li> 3 saat santrifüj32.000 rpm, 4 ° C (r max 175.000 xg) pelet virüs partikülleri. </li><li> Tüpün dibinde pelet rahatsız etmemek için özen, aspirasyon ile süpernatantı. 0.5 ml 1XSTE tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA), 4 tüp ve yere ° C&#39;de 1 saat pelet gevşetmek için. Hafifçe pipetlemeyin yukarı ve aşağı birkaç kez tüp alt pelet ayırmak için geniş çaplı bir 1 ml pipetlemeyin ucu kullanma. Sonraki köpük önlemek için özen gevşetti pelet, 1,5 ml mikrosantrifüj tüp transferi. Küçük öbekler virüs dağıtmak için izin vermek için başka bir 1-3 saat için 4 ° C&#39;de inkübe edin. Bu dönemde, sukroz gradient adım 3.1 &#39;de açıklandığı gibi hazırlayın. </li><li> Yavaşça pipetlemeyin virüs süspansiyon yukarı ve aşağı birkaç kez ve 8,000 rpm (6.000 xg), 4 ° C, 1 dakika boyunca buzdolabında mikrofuge&#39;de santrifüj kalan kümeleri kaldırın. Bu işlem sırasında numune soğuk tutun. </li></ol> 3. Sakkaroz degradeçekirdek izole için santrifüj HIV-1 çekirdekleri HIV-2 çekirdek (10) arıtma için daha önce açıklanan yöntemi bir değişiklik bir &quot;spin-thru&quot; yöntemi 9 kullanılarak izole edilmiştir. <ol><li> 14.5 ml polyallomer SW32.1Ti rotor için bir santrifüj tüpüne 12 ml 1XSTE tampon doğrusal% 30 -% 70 sukroz gradient hazırlayın. Degrade hazırlamak için, eski bir 20 ml degrade kullanmak; yakın tarafında yer% 70 sakaroz çözeltisini 6 ml (çıkış bağlantı noktasına yakın) ve uzak tarafında% 30 sakaroz çözeltisini 6 ml. Hava kabarcıkları, iki odadan birbirine bağlayan kanal kapana kısılmış olmadığından emin olun. Otomatik alttan 1 ml% 85 sakaroz çözeltisini altta içeren tüpün üst degrade pompa eski yoğunlukları Akış degrade kullanın. Yavaşça 4 degrade ° C soğutmalı kadar (2-4 saat). </li><li> Geniş çaplı bir 1 ml pipetlemeyin ucu kullanarak hafifçe 0.25 ml,% 15 sakaroz çözeltisini ile% 1 Triton X-100 içeren STE gradient overlay. </li&gt; <li> Geniş çaplı bir 1 ml pipetlemeyin ucu kullanarak STE% 7.5 sakaroz çözeltisini 0.25 ml yavaşça kaplaması. Katmanları karıştırmak için dikkatli olun. </li><li> Adım 2.4 &#39;ten 0.5 ml virus süspansiyonu ile yavaşça bindirme. Bu adım, herhangi bir degrade bozukluğu ve underlaid sakaroz katmanları karıştırma önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. </li><li> 4 gecede 32.000 rpm (r max 187.000 xg) (16-20 saat) önceden soğutulmuş SW32.1Ti kova ve santrifüj ° C tüpler yerleştirin Santrifüj vakum 250 mikron ulaşıncaya kadar santrifüj duraklamadan önlemek için, santrifüj başlamayın </li><li> 1 ml üstten Otomatik yoğunlukları Akış degrade parçalama kullanarak degrade alt fraksiyonları toplayın. Toplama üzerine tüpler hemen buz koyun. Tüplerin içeriği tersini birkaç kez karıştırın ve ELISA veya ters transkriptaz aktivite assay ölçümü için her bir fraksiyonu 50 ul çekilme. </li></ol> 4. HIV-1 çekirdek yerelleştirilmesive çekirdek depolama <ol><li> Uncoating testleri yapmadan önce, bu kesirler sağlam HIV-1 çekirdek içeren belirlemek için önemlidir. Bu p24 ELISA veya ters transkriptaz aktivite assay adım 3.6 50 ul alikotları kullanarak tespit edilebilir. </li><li> Çekirdeği ile ilişkili CA kurtarma genellikle çekirdek istikrar ile ilgili. P24 ELISA 9 her fraksiyon bir örnek kullanarak çekirdek ilişkili CA ölçün. Alternatif olarak, her bir fraksiyonu ters transkriptaz aktivitesini ölçmek. Her iki yöntem kullanılarak zirveye fraksiyonu 10 civarında olmalıdır. </li><li> Çekirdek içeren fraksiyonları Havuzu. Çekirdek içine toplanmış çekirdek, 0,2 - 0,3 ml alikotları -80 sıvı N2 ve mağaza flaş dondurucu ° C hemen kısım tahlil uncoating için kullanılacak değilse Bu şekilde dondurulmuş Çekirdek uncoating tayini için uygundur. Çekirdek ilişkili CA verimi genellikle p24 mililitrede 1-2 mg veya yaklaşık% 15 toplam virion ilişkilip24. </li></ol> 5. HIV-1 uncoating Kinetik tahlil <ol><li> Uncoating reaksiyon başına gerekli HIV-1 çekirdek miktarı yaklaşık 50 ng. In vitro uncoating tayininde gerçekleştirmek için, süspansiyonun viskozitesini azaltmak için çekirdek kısım soğuk 1XSTE tampon eşit hacimde seyreltme ve pipetleme hataları en aza indirmek için. </li><li> Ayrıca, 0.15 ml, 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 10 mcg / ml BSA içeren soğuk 1XSTE tampon çekirdek 100 ul sulandırmak. Biz tüpün duvarlarına CA adsorpsiyonu en aza indirmek için, BSA (10 mg / ml) ile STE tampon tamamlar. Tersine tüp birkaç kez karıştırın. Örnekleri girdap etmeyin. 37 az bir su banyosunda tüpleri ° C&#39;de zaman aralıklarında (15, 30, 60 ve 120 dk). Tüpler hatta ısınma sağlamak için en azından iç örnek düzeyde su banyosuna daldırılmış olmalıdır. </li><li> İnkübasyon sırasında, yavaşça (genellikle 5 periyodik tüp içeriği karıştırmakTüp Flicking 10 dk). Sıfır dakika kontrolü için, 0.15 ml soğuk 1XSTE tampon içine çekirdek 100 ul sulandırmak ve tüm uzunluğu (120 dk) deney için buz üzerinde inkübe. Sıfır dakika kontrolünde bazal uncoating değeri verir ve 37 ° C farklı zaman aralıklarında inkübe çekirdeği, uncoating artışı belirlemek için kullanılır. </li><li> Kuluçka döneminin sonunda, tüpler 10 dakika boyunca buz koyarak uncoating işlemini durdurmak. </li><li> 45.000 rpm (TLA-55 rotor; r maksimum 125.000 xg) tüpler Santrifüj az 20 dakika süreyle 4 ° C Bu pelet çekirdek uncoating bir sonucu olarak piyasaya sağlam bir çekirdek ve serbest CA süpernatantı kalacaktır. Rotor, 4 ° C örnekleri önce yükleme precooled olmalıdır. </li><li> Tercihen oda sıcaklığında saklanan jel yükleme ipuçları kullanarak yeni precooled mikrofuge&#39;ye tüpleri süpernatantı aktarın. Pelet çıplak gözle görülebilen olmayacağını lütfen unutmayın, bu yüzden, çok dikkatli wsüpernatantı pipetleme hile. ELISA örnek seyreltici (PBS içinde% 0.5 Triton X-100 ve 5% Donör buzağı serumu) 250 ul pelet tekrar ELISA örnek seyreltici ekledikten sonra pelet etkin bir şekilde çözülmesini, vorteks sağlamak. Aşağıdaki bölümde açıklandığı gibi p24 ELISA kullanarak pelet ve süpernatant CA içerik sayısal olmalıdır. </li><li> Uncoating kapsamı süpernatantı CA kesir hesaplanması ile elde edilir. </li></ol> 6. P24 ELISA yöntemi ile CA Testi <ol><li> Birçok ticari ELISA kitleri mevcuttur ve CA ölçmek için kullanılabilir. Kullanın ve herhangi bir ticari veya &quot;in-house&quot; ELISA testinin doğrusallık belirlemek için p24 standartları içerir. Numunelerin çözeltiler doğruluğunu sağlamak için çalışılmalıdır. </li><li> Biz rutin CA için tahlil için kullanabileceğiniz bir ev yapımı ELISA yöntemi geliştirdik. Prosedür, bir önceki rapordan 11 uyarlanmıştır ve NIH YARDIM edinilebilir yakalama ve dedektör antikorlar kullanılarak yapılırS Araştırma ve Referans Reaktif Programı. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: ELISA sonucu çekirdek içeren fraksiyonları belirlemek için bir örnek Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Fraksiyonları (1 ml) topladıktan sonra, her bir fraksiyonu 50 ul örnek seri dilüsyonları yapmak için kullanılır ve ELISA yöntemi ile analiz edilmiştir. Oniki kesirler değerler ekleyerek elde edilen toplam p24 14.5 mikrogram oldu. Rakam kesirler 8 ile 10 çekirdeği içerdiği gösterilmiştir. Çekirdek içeren fraksiyonlar için p24 değeri 2.17 mg. Çekirdek kesirler için p24 değeri oranı (2.17 mcg), toplam p24 değeri (14.5 mikrogram) alarak çekirdek ilişkili p24 yüzdesi (% 14.97) tespit edildi. Kesir 1 veya 2, p24, her zaman yüksek miktarda içerir; bu çekirdek ile ilişkili değildir ücretsiz CA temsil eder. Bu, sonraki her fraksiyonu ile p24 değerleri kademeli olarak azaltılması, sonra keskin bir artış ve p24 nihayet keskin bir düşüş takip ediyordeğerleri. Degrade yüklenirken uygun bakım alınırsa sonra çekirdek ilişkili CA zirve fraksiyonu 10 civarında bulunmuştur. HIV-1 çekirdek uncoating kinetiği assaying elde edilen tipik bir sonucu Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Grafik, yabani tip HIV-1 çekirdek uncoating bir zamana bağımlı bir artış gösterir. Süpernatantı CA kesir hesaplanmak suretiyle yüzde uncoating değeri elde edildi. Uygulama ile, testin yüksek tekrarlanabilir ve in vitro olarak viral çekirdek istikrar belirlemek için yararlıdır. Testin tekrarlanabilirliği, işlem sırasında örneklerin uygun taşıma son derece bağımlı olduğunu lütfen unutmayınız. Çekirdek ısıya dayanıksız olduğundan, örnekleri ° C tahlil boyunca kuluçka dönemi sırasında dışında 4 muhafaza edilmelidir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" /> Şekil 1 Denge yoğunluk gradiyenti santrifüjHIV-1 çekirdek. % 1 Triton X-100 ile üst üste% 30 ila% 70 doğrusal sukroz gradient üst konsantre bir virüs süspansiyonu uygulandı. 187.000 xg ve 4 geceleme santrifüj sonrasında ° C, 1 ml kesirler yukarıdan aşağıya (Kesir 1) (Kesir 12) toplandı ve p24 ELISA yöntemi ile belirlendi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" /> In vitro HIV-1 uncoating 2 Saat dersin Şekil. Saflaştırılmış HIV-1 çekirdekleri ° C belirtilen zaman aralıkları için seyreltilmiş ve 37 saat inkübe edildi. Sıfır min örnek deney tamamı boyunca buz üzerinde inkübe edildi. Inkübasyon sonrasında, örnekler 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 125.000 xg&#39;de ultra santrifüje edildi Süpernatant ve pelet p24 ELISA ile ayrılmış ve analiz edildi. Protokol metninde açıklandığı gibi uncoating bir ölçüde tespit edildi. Her uncoating tepki yinelenen yapıldı; hata çubuklarını iki değer aralığına yayılır.

<ol>
	<li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core.">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li><li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein.">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li><li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating.">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li><li>Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication.">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li><li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex.">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li><li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating.">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 485, 41-53 (2009).</li><li>Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Nef+with+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+core.">Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core.</a> J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).</li><li>Kewalramani, V. N., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vpx+association+with+mature+core+structures+of+HIV-2.">Vpx association with mature core structures of HIV-2.</a> Virology. 218, 159-168 (1996).</li><li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents.">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12, 288-293 (1997).</li><li>Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kr&#228;usslich, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+structural+analysis+of+isolated+mature+cores+of+human+immunodeficiency+virus+type+1.">Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).</li><li>Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kr&#228;usslich, H. G., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+authentic,+mature+HIV-1+virions+and+cores.">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li><li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation.">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li><li>Accola, M. A., Ohagen, A., G&#246;ttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores:+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6(gag.">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yöntem, hedef hücreleri, HIV-1 uncoating analiz etmek için geçerli bir yöntem olmaması nedeniyle bu aşamada, HIV-1 yaşam döngüsü eğitimi için yararlı in vitro uncoating çalışmada HIV-1 çekirdek arındırmak için buraya nitelendirdi. Bu yöntem, çekirdek arındırmak için denge Ultrasantrifügasyon kullanıyor olsa da, diğerleri ile kısa Parçalama işleminden sonra doğrudan peletleme kullandık% 1 Triton X-100, 12, 13 ya da% 0,1 Triton X-100, 14, 15 ile üst üste sakaroz...

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> Reaktifi Adı </td><td width="197"> Şirket </td><td width="114"> Katalog numarası </td><td width="161"> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Mallinckrodt Baker A.Ş. </td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros </td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.25 &#39;lik tripsin-EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td> Kompozisyon: 50mm BES [p H 6,95], 280 mM NaCl ve 1.5 mM Na 2 HPO 4. PH 6.95 ile ayarlayınoda sıcaklığında. Sterilize &amp; Süzgeç alikotları -20 ° C&#39;de saklamak, </td></tr><tr><td> Kaplama antikor: p24 için monoklonal antikor (183-H12-5C) </td><td> NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktifi Programı </td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td> Primer antikor: HIV-Ig (hiper-immün insan hasta serum) </td><td> NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı </td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td> İkincil antikor: Keçi anti-insan IgG, konjuge peroksidaz </td><td> Delmek </td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP substrat </td><td> KPL Inc. </td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB 96 kuyucuğu </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32Ti ve SW32.1 Ti rotorları ve uyumlu ultrasantrifüjdeki </td> &lt;td&gt; Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA-55 rotor ve masaüstü ultrasantrifüjdeki </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Yüksek hızda mikrofuge&#39;ye borular </td><td> Beckman Coulter </td><td> 326.823, 358.123, 357.448 </td><td></td></tr><tr><td> Otomatik yoğunlukları Akış yoğunluk gradiyenti parçalama </td><td> Labconco Corp. </td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td> Gradient Eski </td><td> CBS Bilimsel A.Ş. </td><td> GM-20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating of hiv-1 cores

Retrovirüsler genom lipid bir zarf tarafından çevrili bir kapsid kaplı. HIV-1 olarak lentiviruses için altıgen bir kafes olarak düzenlenmiştir CA protein, konik kapsid kabuk oluşur. Kapsid dar sonunda koni 1, 2, 7 pentamers geniş sonunda ve 5 kapalı . Bu kapsid kabuk kaplı viral ribonükleoprotein kompleksi ve birlikte çekirdek oluşturur. HIV-1, hedef hücre zarı ile viral membran füzyonu takiben, sitoplazmaya salınır. Kapsid sonra uncoating olarak adlandırılan bir süreç içinde çözünür formu 3 CA serbest bırakmadan sökülebilir. HIV-1 uncoating hücre içi konumu ve zamanlama tam olarak anlaşılamamıştır. Kapsid istikrarı değiştirmez CA Tek amino asit yer değiştirmelerin hücreleri 4 bulaştırmak için de HIV-1 yeteneğini bozar. Bu kapsid istikrarı HIV-1 enfeksiyonu için kritik olduğunu gösterir. </p&gt; HIV-1 uncoating Bu işlem için duyarlı ve güvenilir testlerin mevcudiyeti eksikliği nedeniyle çalışma zor olmuştur. Burada bulaşıcı HIV-1 parçacıkları izole çekirdeği kullanılarak in vitro uncoating çalışmak için kantitatif bir yöntem açıklanmaktadır. Yaklaşımı soğuk, deterjan ve doğrusal bir sukroz gradient katmanı üzerinden konsantre virionlar sedimentasyon çekirdek izolasyonu içerir. Uncoating ölçmek için, izole çekirdek 37 inkübe ° C çeşitli zaman aralıklarında ve Ultrasantrifügasyon tarafından sonradan pelet. Uncoating kapsamı süpernatantı CA kısmını nicel analiz edilir. Bu yaklaşım, HIV-1 kapsid istikrar 4, 5, 6 viral mutasyonların etkilerini analiz etmek için istihdam edilmiştir . Ayrıca HIV-1 uncoating hücresel faktörlerin rol çalışmak için yararlı olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Uncoating of HIV-1 Cores at JoVE.com

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating HIV-1 yaşam döngüsünün ilk aşamasında önemli bir adım ve kapsid kabuk sökülmesi ve viral ribonükleoprotein kompleksi (vRNP) serbest bırakılması olarak tanımlanır. Burada, HIV-1 virionlar sağlam çekirdek tecrit ve bunların uncoating ölçülmesi için teknikleri göstermek<em&gt; In vitro</em&gt;.

HIV-1 Çekirdek in vitro Uncoating

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

15.6K Görüntüleme.  Vanderbilt University School of Medicine. Uncoating HIV-1 yaşam döngüsünün ilk aşamasında önemli bir adım ve kapsid kabuk sökülmesi ve viral ribonükleoprotein kompleksi (vRNP) serbest bırakılması olarak tanımlanır. Burada, HIV-1 virionlar sağlam çekirdek tecrit ve bunların uncoating ölçülmesi için teknikleri göstermek In vitro.

Video: In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

Bir<em&gt; In vitro</emOkumak&gt; Co-enfeksiyon Modeli<em&gt; Plasmodium falciparum</emİnsan İlköğretim Monosit kökenli Bağışıklık Hücrelerde&gt;-HIV-1 Etkileşimleri

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

Bir Kısıtlama Enzim Temelli Klonlama Yöntemi değerlendirin<em&gt; In vitro</em&gt; HIV-1 Tipi C Gag-MJ4 Kimerik Virüslerin Çoğaltma Kapasitesi

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 pozitif Bireylerin Plazma eksozomlann izolasyonu

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Dev ünilamellar vesikül (GUV) membranlanna bağlanan, HIV-1 Gag Görselleştirme

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV-1 ile infekte Canlı İlköğretim İnsan Makrofagların Ölçülen fagosom Göç ve Hız

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

Ölçümü<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...