Kör Meksika mağara balığı olarak da bilinen Astyanax mexicanus, özellikle adaptif genetik özelliklerin evrimini anlamak için, biyolojik bilimde çeşitli araştırma alanları için örnek bir organizma olarak ortaya çıkmaktadır. Bu tür, nehirde yaşayan bir yüzey morfolojisi ve aynı türden iki popülasyonun zaman içinde nasıl farklı olduğunu analiz etmemizi sağlayan bir mağarada yaşayan morfolojiden oluşur. Ancak, bu araştırmanın gerçekleşebilmesi için sağlıklı zaman uyumlu embriyolar ve melez geçişler elde edebilmeliyiz.
Bu tür kolayca korunur ve laboratuvarda yetiştirilen balık öncelikle gündüz taze döşenmiş embriyolar elde etmek için zor hale gece saatlerinde yumurtlamak. Bu protokolde, Astyanax mexicanus'u değişen ışık döngülerine ve sıcaklık değişimlerine alıştırarak üreme döngülerini günün daha uygun bir saatine kaydırabildiğimizi gösteriyoruz. Daha sonra, uygun ebeveyn balık belirlemek ve anestezi erkek ve dişilerden gamet toplamak nasıl göstermek.
Son olarak, in vitro fertilizasyon kullanarak canlı yavrular üretmek ve başarılı döllenme belirtileri tartışmak nasıl göstermek. Bu protokolün genetik yapı enjeksiyonu ve gelişimsel analiz gibi işlemlerin normal çalışma saatlerinde kolayca yapılmasını sağlamasını bekliyoruz. Buna ek olarak bu teknik tüm mağara ve yüzey de yaşayan popülasyonlar arasında melez outcrosss oluşturmak için yararlı olabilir.
Birden fazla tank satırı içeren opak, tamamen kapalı bir akış kültür balıkçılığı sistemi içinde balık tankları ayarlayın. Astarlama işlemi sırasında sıcaklığı manuel olarak değiştirmek için kullanılan bağımsız bir ısıtma elemanı ile her tankın sıcaklığını koruyun. Her birinde ayrı fotoğraf dönemleri sağlayacak şekilde tek tek satırlar ayarlayın.
Işığın girmesini veya kaçmasını önlemek için kapatılabilir her satıra kapılar tökezleyin. Otomatik denetleyici, balıklara en az rahatsızlık verebilen tüm fotopertlerin manipülasyonuna olanak sağlar. Karanlık saatlerde erişmek için rafı kırmızı iş Lambası ve karartma perdeleri ile donatın.
Genel sistem raflarından istenilen balığı çıkarın ve astarlamadan 14 gün önce fotoperinin ayarlanması için üreme raflarına yerleştirin. Bu balık yeni bir ortama alışmak için izin verir. Yüklü suısıtma sistemi kullanarak bu dönemde 22,8 santigrat derece balık tutun.
Normal fotoperiyot altı a.m. ile sekiz p.m ışık ve sekiz p.m' dir.
altı a.m.karanlık. Hafif çevrim rafı için fotoperi 10 p.m.'den 12 p.m kaydırın.
ve 12 p.m. için 10 p.m. raf içindeki ışığa güç veren zamanlayıcıyı ayarlayarak koyu.
Balıklar alıştıktan sonra yumurtlamak için hayvanları astarlamaya başlarlar. Bu, toplamda altı gün süren bir işlemdir. Bu süre içinde yüklü bir suısıtma sistemi kullanarak ova üretimi asal sıcaklık değiştirin.
İlk gün sıcaklığı 22.8 santigrat dereceye yükseltin. İkinci gün sıcaklığı 24.4 santigrat dereceye yükseltin. Üçüncü ve dördüncü günde sıcaklık 26.1 derece.
Balıklar gün içinde yumurtlamaya hazır olacak ve tüp bebek yapılabilir. Beşinci gün sıcaklığı 26,1 santigrat dereceden 24,4 santigrat dereceye düşürün. Altıncı günde sıcaklığı 24.4 santigrat dereceden 22.8 santigrat dereceye düşürün.
Bu sıcaklık döngüsünü tekrarlamadan önce yedi günlük bir boşluk sağlayın. Bu, balığın değişen ışık döngüsüne uyum sağlamak için ihtiyaç duyduğu toplam süreyi azaltacağı için balığı bu fotodönemde tutmaya devam etmenizi öneririz. Nemli bir mendil inşayarak petri kabının kapağına silinerek ve nemlendirici bir oda oluşturmak ve toplama işlemi sırasında ovanın kurumasını önlemek için kabı kapatarak başlayın.
Sonraki koleksiyon için bir kadın seçin. Büyük çıkıntılı karınları ile Gravid balık muhtemelen bu işlem için en iyi seçim olacaktır. Soğutulmuş su kullanarak bir kadın immobilize ve nemli bir sünger hayvan tutucu supine pozisyonda yerleştirin.
Bir kez su ile temas olarak hassas bir doku silme ile balık ventral tarafı konumlandırılmış ova aktive neden olacaktır. Dişiyi başparmak ve işaret parmağı arasında tutun. Hafifçe parmak haddeleme sırasında ürogenital açılış yönünde coelomic kavitenin lateral taraflarına hafifçe sıkmak.
Tek kullanımlık bir spatula kullanarak ifade ova toplamak. Bunları nemli Petri kabına aktarın. Belirli ebeveynlik verileri gerekli değilse, aynı çanakta birkaç debriyaj birleştirilebilir.
Topladıktan sonra yavaşça sistem suyu ile dolu bir kurtarma tankı balık geri dönün. Koleksiyon için bir erkek seçin. Erkek gamet kalitesi dıştan görünür hiçbir belirti vardır.
Ancak, balık bu işlemde kullanılmadan önce sağlıklı bir görünüm ortaya çıkmalıdır. Soğutulmuş su kullanarak bir erkek immobilize ve nemli bir sünger hayvan tutucu supine pozisyonda yerleştirin. Su ile temas olarak hassas bir doku silme ile balık ventral tarafı blot milt aktive edecektir.
Kılcal tüpün ucunu ürogenital açıklığa yavaşça yerleştirin. Başparmak ve işaret parmağı ile balık yanlarında hafif basınç uygulayarak milt sınırdışı. Ürogenital açıklığa doğru hareket eden solungaçlara distal başlayın.
Bir kılcal tüp sonunda milt toplamak. Hafif emme bir aspiratör tüp kullanımı ile gerekli olabilir. Milt ile sınırdışı edilebilir herhangi bir dışkı kaçının.
Boş bir 1.5 mililitrelik santrifüj tüp içine milt dağıtın ve sperm genişletici E400 iki katı hacmi ile seyreltin. Buzda kal. Belirli ebeveynlik verilerine gerek yoksa, birden fazla erkekten milt bir araya getirilebilir.
Bu adım milt çalışma süresini birkaç saat uzatmak için kullanılabilir, ancak hemen döllenme için gerekli değildir. Topladıktan sonra yavaşça sistem suyu ile dolu bir kurtarma tankı balık geri dönün. Her stok için yeni bir pipet kullanarak sperm borulama ve / veya sperm ve milt olarak döllenme önce tüp yanları ajitasyon ve zaman içinde E400 çözeltisi yerleşmek tarafından sperm karışımı.
Milt veya uzatılmış milt çözeltisini taze toplanan ovaya dağıtın. Hızlı bir şekilde döllenme için sperm ve yumurta etkinleştirmek için debriyaj sistem suyu bir mililitre ekleyin. Çanak içeriğini karıştırmaktan veya ajitasyondan kaçının ve döllenmenin gerçekleşmesi için iki dakika bekleyin.
Çanak 2/ 3 tam doldurmak için E2 embriyo medya ekleyin. Sonraki prosedüre bağlı olarak embriyolar ya hemen downstream uygulamaları için kullanılabilir ya da onlar beş gün sonra döllenme ulaşana kadar 23 santigrat derece E2 embriyo media inkübülebilir. Bu noktada embriyoları sistem suyunu kullanarak ana recirculating konut sistemine transfer ediyoruz.
Bu yöntemin en büyük gücü Astyanax mexicanus mağara ve yüzey melezlerinin güvenilir üretimidir. Geleneksel hibrid üretim yöntemleri, astyanax mexicanus'un mağara morfolojisinde sirkadiyen ritmin kaybolması nedeniyle çok zordur ve bu da bu balıkların yumurtlama sürelerinin değişmesine neden olur. Astyanax mexicanus başarılı bir IVF prosedürü için toplanan ova kalitesi büyük önem taşımaktadır.
Büyük çıkıntılı karınları ile Gravid dişi balık en uygun ova serbest bırakmak için muhtemeldir, hangi açık görünür ve hatta görünüşte. Toplanan miltin bu ovaya eklenmesi genellikle 20-30 dakika içinde döllenmiş embriyoların gelişmesine neden olabilir. Canlı embriyolar gelişim döngüsünün tek hücre aşamasına girmeden önce biraz daha yarı saydam hale gelecektir.
Döllenmemiş ova daha düzensiz ve opak görünür. Tenaja mağara balığı ve yüzey balıkmelezleri oluşturmak için IVF kullanarak bir morfolojik fenotipler geniş bir yelpazede inceleyebilirsiniz. Örneğin, yüzey/ mağara melezleri gözlerin varlığını gösteren gözlere sahiptirler baskın bir özelliktir.
Ancak yüzey mağarası F2 melezlerinde, Astyanax mexicanus'ta göz boyutunu kontrol eden ve kantitatif bir özellik haline getiren birden fazla loci olduğunu gösteren geniş bir göz büyüklüğü yelpazesi elde ediyoruz. Başka bir örnek pigmentasyon olduğunu. Yüzey ve mağara balıklarının F1 melezini gözlemleyerek, balıklar tamamen pigmente edildiği için vücut pigmentasyonunun baskın bir özellik olduğu sonucuna varılabilir.
F2 kuşağında vücut pigmentasyonundaki değişim yine nicel bir özelliği işaret eder. Bu fenotipik verilerin sıralama verileri ile birleşimi, bu fenomenlerden sorumlu genetik loci'nin altında yatan bilgileri ortaya çıkarabilir. Bu protokolde Astyanax mexicanus'un üreme döngülerini günün daha uygun saatlerine kaydırmayı ve tüp bebek kullanarak sağlıklı canlı embriyolar elde etmeyi öğrendik.
Erken evre embriyolarla çalışmaya izin vermenin yanı sıra sperm kriyoppreservation'ın gelecekte araştırılmasını da sağlar. Bu tekniğin standardizasyonu erken gelişimsel ve genetik çalışmalar için bir model sistem olarak Astyanax mexicanus güçlendirir.
