Name: genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs at JoVE.com

Bu çalışma Genetik, Kalkınma ve Hücre Biyolojisi ve Iowa State Üniversitesi Bölümü tarafından ve NIH hibe EY024941 (WJ) .Dr tarafından finanse edildi. Jeffrey Essner el yazması üzerine yorum sağladı.

Bütün hayvan prosedürleri Ulusal Sağlık Enstitüleri kılavuzlarına uygun olarak ve Iowa Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Maryland Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. TALEN Tasarım <ol><li> Bir TALEN tasarım web sitesine giriş istenen hedef dizisi. (Örneğin <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Giriş boşluk / tekrar dizi uzunlukları seçildi. <ol><li> &quot;Dizi&quot; etiketli kutunun içine genomik dizisi kopyalayın. </li><li> &quot;Özel Spacer / RVD Uzunlukları sağlayın&quot; sekme içinde boşluk uzunluğu ve dizi uzunluğunu seçin. Not: 15 baz çiftlerinin Spacer uzunlukları ve iyi 15-17 iş dizi uzunlukları tekrarlamak ve montaj az karmaşık hale getirmektedir. </li></ol></li><li> Bir TALEN çiftini seçin. benzersiz sınırlama enzimi noktasının etrafında tasarlanmış TALEN çiftleri kısıtlama enzimi tarafından genotipleme sindirilmesi izinBir PCR ürünü,. </li><li> Tasarım primerler gibi Primer3 30-32 gibi web sitesini kullanarak TALEN hedef alanını çevreleyen genomik bölgeyi yükseltmek için. bir kısıtlama enzimiyle genotipleme olduğunda, astar tasarımı bir kere kısıtlayıcı enzim merkezi ihtiva eden bir bölümünün yükseltilmesi için. Bölgenin büyütülmüş ve A içinde mevcut olan herhangi polimorfizmlerini tespit etmek TALEN yapı önce dizilenmiştir önerilir mexicanustan laboratuar popülasyon mikro enjeksiyon için kullanılmak üzere. </li></ol> (TALEN Kit Protokolü Modifiye) 2. TALEN Meclisi 33,34 Ek ayrıntılar ve sorun giderme için protokol 34 bkz. <ol><li> Hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre TALEN kiti gerekli plazmidler sırası. </li><li> reaksiyonlar A ve B için 1 reaksiyonlar tekrar değişkenli diresidues (RVDs) 1-10 ve Reaksiyon A. hedef vektör pFUS_A RVDs dahil 11- dahil # (N-1) ve th kurmakN talen bölgesindeki RVDs sayısı e hedef vektör pFUS_B Reaksiyon B (n-1). <ol><li> Her reaksiyon ekleyin: Her RVD (100 ng / | il), hedef vektör (100 ng / | il), 1 ul Bsa I kısıtlayıcı enzim, 1 ul Sığır Serum Albumin (BSA) (2 mg / ml ihtiva eden her bir plazmid, 1 ul ), 1 ul ligazı, 20 ul toplam hacim su ul 10x ligaz tamponu ve x 2 ul. Örneğin, bakınız Tablo 1. Not: yarım reaksiyonları da kullanılabilir. </li><li> Bir PCR reaksiyonları yerleştirin ve döngüyü çalıştırın: 10x (37 ° C / 5 dk + 16 ° C / 10 dk) + 50 ° C / 5 dk + 80 ° C / 5 dk. </li></ol></li><li> nükleazı ile reaksiyonları inkübe edin. Her reaksiyon için 1 ul 25 mM ATP ve 1 ul nükleaz ekleyin. 1 saat süre ile 37 ° C &#39;de reaksiyonlar inkübe edin. </li><li> Tepkiler Transform. <ol><li> Kimyasal olarak 25 ul yetkin hücreleri her bir reaksiyonun 2.5 ul dönüşümü. Not: Ev yapımı yetkili carşın kullanılabilir. Bununla birlikte, düşük yetkinlik hücreler koloni eksikliği ile sonuçlanabilir. <ol><li> kimyasal olarak yetkin hücre 25 ul reaksiyon 2.5 ul karıştırın. Beş dakika süre ile buz üzerinde inkübe edin. 42 ° C&#39;de 30 saniye boyunca inkübe hücreleri. </li><li> 2 dakika boyunca buz üzerinde tüpler yerleştirin. Katabolik baskı (SOC) ile Süper Optimal suyu 125 ul ekleyin. 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de tüpler çalkalayın. </li></ol></li><li> Plaka spektinomisin (50 ug / ml) LB plakaları üzerine dönüştürülmüş hücreler, 100 ul, X-gal ve izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG). 37 ° C sıcaklıkta O / N büyütün. </li></ol></li><li> Her reaksiyon için 2-3 Beyaz koloniler ve primerlerin pCR8_F1 ve pCR8_R1 (Tablo 2) kullanılarak koloni PCR ile kontrol edin. <ol><li> reaktiflerin bir ana karışımı olun. Örneğin, bakınız Tablo 3. </li><li> Bir koloni seçin ve bir PCR tüp dibine onu yayma ve daha sonra spektinomisin ile 2 ml LB içine koloninin kalıntılarını koymak(50 ug / ml). koloniye ile tüpe ana karışımı 15 ul yerleştirin. </li><li> Aşağıdaki PCR programını çalıştırın (Tablo 4) </li><li> elektroforez ile% 1.5 agaroz jel üzerinde PCR (tüm birimi çalıştırın) kontrol edin. Doğru klonlar, beklenen boyutta bir bant gibi bir yayma ve bantların bir merdiven olacaktır. Uygun smear örneği için 34,33 bkz. </li><li> bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C&#39;de LB ortamı O / N doğru klon 2 mi kültür büyütün. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak plazmidler miniprep. </li><li> Sıra pCR8_F1 ve pCR8_R1 ile TALEN dizisini kontrol etmek için. Daha önce tarif edilen metotlar 35 izleyin. </li><li> dizisi ile doğrulandı doğru klonlar kullanarak, hedef vektörü içine A ve B vektörleri ve son RVD gelen RVDs yerleştirir reaksiyon 2. (TALEN kiti) kurmuştur. <ol><li> Reaksiyonun 2 (Tablo 5) karışımı hazırlayın. Not: HaEğer reaksiyonları kullanılabilir. </li><li> Bir PCR reaksiyonları yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 37 ° C / 10 dk + 16 ° C / 15 dk + 37 ° C / 15 dk + 80 ° C / 5 dk. </li></ol></li><li> Tepkiler Transform. <ol><li> Kimyasal olarak 25 ul yetkin hücreleri her bir reaksiyonun 2.5 ul dönüşümü. <ol><li> kimyasal olarak yetkin hücre 25 ul reaksiyon 2.5 ul karıştırın. 5 dakika buz üzerinde inkübe edin. Isıtma 42 ° C&#39;de 30 saniye boyunca hücrelerin şok. </li><li> buz üzerinde tüpler yerleştirin. SOC 125 ul ekleyin. 1 saat süre ile 37 ° C &#39;de çalkalayıcı bir inkübatör içinde tüpler yerleştirin. </li></ol></li><li> Plaka ampisilin (100 ug / ml), X-gal ve IPTG ile LB levhaları üzerine dönüştürülmüş hücreler 100 ul. 37 ° C sıcaklıkta O / N büyütün </li></ol></li><li> Her reaksiyon için 1-3 Beyaz koloniler ve koloni PCR ile primerler TAL_F1 kullanarak TAL_R2 (Tablo 2) ile kontrol edin. <ol><li> polimeraz master, su ve primer olarak bir çözeltisini yapmakTablo 3&#39;te tarif edilmiştir. Bir koloni almak ve bir PCR tüpünün dibine smear ve ampisilin (100 ug / ml) ile 2 ml LB içinde koloninin kalıntılarını koydu. koloni tüpe çözeltisi 15 ul koyun. </li><li> PCR programı (Tablo 6) çalıştırın. </li><li> elektroforez ile% 1.5 agaroz jeli üzerinde PCR edin. Doğru klonlar bulaşmasını ve bantların bir merdiven olacak. Uygun smear örneği için 34,33 bkz. </li><li> bir çalkalama inkübatöründe 37 ° C&#39;de LB ortamı O / N doğru klon 2 mi kültür büyütün. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına uygun olarak plazmidler miniprep. </li><li> Dizi TAL_F1 ve TAL_R2 daha önce tarif edilen metotlar 35 aşağıdaki TALEN sekansını kontrol etmek için. </li></ol> Talens 3. mRNA transkripsiyonunu <ol><li> 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca 2 ul Sac I ile dizi-belirlenmiş şablon 4 ug Digest. </li&gt; <li> Elektroforez ile% 1.5 agaroz jeli üzerinde Sac I ile sindirilmiş plasmid 2 ul çalıştırın. Doğru sindirilir Plazmidler tek bant gösterecektir. </li><li> PCR saflaştırma kiti protokolü sonra, kalan Sac I ile sindirilmiş plasmid saflaştırılır. Elüsyon önce yıkama çözeltisi ile iki kez yıkanır. nükleaz içermeyen su 30 ul içinde yıkayın. </li><li> T3 mRNA üretimi için standart bir protokol izleyin. <ol><li> Lineerleştirilmiş şablonun 0.5 mikrogram ile yarım reaksiyonları kurmak (yukarıda hazırlanan). 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> DNase (kiti içinde bulunur), 0.5 ul ilave edin ve 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarını izleyerek mRNA arındırın. 30 ul nükleaz içermeyen su içine Zehir. </li><li> mRNA kontrol etmek için elektroforez ile% 1.5 agaroz jel çalıştırın. <ol><li> RNaz kontaminasyonu ortadan kaldırmak ve% 1.2 jel hazırlamak için bir ürün ile jel aparat temizleyin. </li><li> Karışım 1 ul mRNA + 4-# 181; l nükleaz içermeyen su + 5 ul glioksil yükleme boyası. 30 dakika boyunca 50 ° C&#39;de inkübe edin. jel çalıştırmadan önce buz üzerinde santrifüj tüplerine kısaca ve yer. </li></ol></li><li> nükleik asit konsantrasyonlarının ölçülmesi için bir yöntem kullanarak yoğunlaştırma kontrol edin ve -80 ° C&#39;de parçalar halinde saklayın RNA. RNA / dondurulmuş birden fazla çözülmüş değildir, öyle ki, bir kısım boyutu seçin. Not: 500-1000 ng konsantrasyonlar / nl genellikle elde edilir. RNA bütünlüğü korunur (a bant yerine jel üzerinde yayma tarafından değerlendirilir) daha düşük bir konsantrasyonda RNA sürece kullanılabilir. </li></ol> TALEN mRNA ile 4. enjekte Astyanax mexicanustan Embriyolar <ol><li> Enjeksiyon için Araçlar hazırlayın. <ol><li> bir petri içine balık su (sodyum bikarbonat ve deniz tuzu pH 7.4 ve iletkenlik 700 mS ile şartlandırılmış su)% 1.2 agaroz dökerek enjeksiyon plakaları dökün. balık kuyu olmak için çıkıntılar olan bir kalıbın (plastik parça yerleştirinçanak içinde yumurta). 4 ° C&#39;de agaroz sertleşmiş kalıp ve mağaza çıkarın. Kalıpta ayrıntılar 36 için bkz. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bir iğne çektirmenin kullanarak enjeksiyon için iğne çekin. Not: Uygun iğne uzunluğu enjeksiyonlar için önemlidir. çok uzun olan iğneler enjeksiyonlar için çok esnek olacaktır. çekerek iğne protokol iğneler çekmek için kullanılan ekipman ile değişecektir. Uygun bir iğne bir örnek bizim ekipman için, uzunluğu 5-6 cm iğne çekin. Şekil 1&#39;de gösterildiği ve kırıldığı zaman yaklaşık 0.011 mm ucunda bir dış çapa sahip olduğu. Ancak, iğneler açılış genişliğini belirlemek için (adım 4.3.4) kalibre edilmelidir. Iğneler çekmek için bir örnek program Tablo 7&#39;de bulunabilir. </li><li> bir yumurta geçmesine açılış yeterince büyük ve böylece pipet kırarak embriyo transferi için cam pipetler hazırlayın. kırık ucu kadar Alevartık keskindir. Not: A. ile çalışırken cam pipetler ve cam kase kullanmak önemlidir mexicanustan yumurta ve embriyo onlar yapışkan ve plastik uyacaktır olarak. </li></ol></li><li> 1-hücreli Sahne Yumurta toplayın. <ol><li> Irk A. mexicanustan standart protokoller 37 Aşağıdaki. Not: Örneğin, balık 14 ışık tutulur eğer: 10 karanlık döngüsü ve ışıklar kapalı olarak ve ZT14 ışıkları olarak ZT0 ile Zeitgerber zaman (ZT) kullanılarak, ZT15 ve ZT19 tarihleri ​​arasında yüzey balık yumurtlamak. Tam yumurtlama zamanı her laboratuar için tespit edilmelidir. </li><li> çiftleşme öncesi 3-4 gün balık fazla besleme ve taze suya balık koyarak yumurtlama neden olur. Sıcaklık 2 ° F kaldırın. Not: Bizim ilk su sıcaklığı yaklaşık 74 ° F. </li><li> 1 hücre aşamada yumurta elde etmek için her 15 dakikada kontrol karanlıkta yüzey balık yumurta toplamak. yumurta yüz yüzeyi balık tek bir çift elde edilebilir. </li><li> Toplamakcam kase yumurta plastik yüzeylere yapışmasını önler ve sıralama mikroskop altında yumurta gözlemleyerek ve tek bir hücre olan yumurta toplama yoluyla enjeksiyondan önce 1 hücre aşamasında embriyoların izole etmek. (PH ve iletkenlik için işlem görmüş yetişkin balıklar yer aldığı bir hazne suyu,), taze sistem suda yumurta tutun. </li></ol></li><li> TALEN mRNA enjekte. <ol><li> toksisite ve etkinlik TALEN çift değişir gibi enjeksiyon için uygun konsantrasyonu belirlemek için toplam mRNA (çiftteki her talen eşit miktarlarda) farklı miktarlarda enjekte edilir. 400-800 pg olan toplam mRNA konsantrasyonlarını enjekte ederek başlayın. Seyreltilir ve 1.5 NL enjekte edilmesi için istenen konsantrasyonlara mRNA birleştirir. </li><li> Yük iğnenin arkasına mRNA seyreltilmiş ve bir mikro-enjektöre iğneyi takın. </li><li> forseps kullanarak iğne kırın. </li><li> iğne kalibre edin. Örneğin, 10 kez çıkarma ve bir mikro kapiller gerilemesi toplar. 10 x 100 atılabilir 1.081 l, 32 mm mikro kılcal, damla 1.5 nl / 1 enjeksiyon için 0.5 mm mikro kılcal doldurmalıdır. Gerektiğinde enjeksiyon zamanı ve basıncını ayarlayın. </li><li> tek hücre içine iğne takın ve mRNA enjekte edin. değil sarısı içine, hücre içine doğrudan mRNA enjekte edilir. </li><li> cam kase enjekte embriyolar toplayın. 23-25 ​​° C embriyolar tutun. ölü embriyolar düzenli enjeksiyonu takiben ilk birkaç gün için (bulutlu ve düzensiz şekilli hale embriyolar) çıkarın. kontrol (uninjected) ve enjekte edilen levhalardan ölü ve deforme embriyoların rekor numaraları. Not: Artan mRNA konsantrasyonu artmış toksisite ve embriyo deformite / ölüme yol açabilir. Bu nedenle, randıman karşı toksisiteyi enjekte mRNA iyi konsantrasyonunu belirlemek için dengelenmelidir. </li></ol></li></ol> 5. Fenotip Kurucu Balık ve TALEN Verimliliği değerlendirin <ol><li> kurumsal hayvan protokole göre embriyolar Kurban. Not: euthanizeHızlı tarafından embriyolar buz üzerinde ürpertici. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak 0,8 ul PCR şerit tüpler içine embriyolar toplayın. Not: Genotiplendirme bireysel embriyolar veya embriyoların havuzları üzerinde gerçekleştirilebilir. </li><li> DNA ayıklayın. <ol><li> 100 ul 50 mM sodyum hidroksit (NaOH) içine yerleştirin embriyolar 4 ° C&#39;ye soğutun, 30 dakika boyunca 95 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1 M Tris-HCI pH 8 1/10 hacmi (10 ul) eklenir. </li></ol></li><li> Adım 1.3 tasarlanan primerler (örnek protokoller için masalar 8 ve 9 bakınız) kullanarak bölgede bir PCR gerçekleştirin. Bireysel embriyolar için DNA 1 ul PCR reaksiyonu için yeterlidir. </li><li> uygun kısıtlama enzimi ile elde edilen PCR ürünü sindirimi ve elektroforez ile% 1.5 agaroz jel üzerinde çalıştırıldı. <ol><li> Örneğin, enjekte edilen embriyolar okülokütanöz albinizm 2 (OCA2) odağı genotipleme için 0 ekleyerek kısıtlama enzimi Bsr kullanıyorum PCR ürünü sindirmek2 saat boyunca 65 ° C&#39;de inkübe tamamlanmış PCR reaksiyonunun 12.5 ul e BSR doğrudan I .5 ul. sindirilmemiş ve bir jel üzerinde sindirilmiş ürünü çalıştırın. Kısıtlama enzimi dayanıklı grupları (yani, sindirimi olmayan bantları) TALEN kaynaklı mutasyon mevcut olan (Şekil 2) olduğunu göstermektedir. </li></ol></li><li> (İsteğe bağlı), daha önce tarif edildiği gibi 29 Her bir bandın şiddeti değerini hesaplamak için jel analizi alet Fiji 38 jel görüntüleri analiz ederek kesilmemiş ürünün yüzdesi belirlenerek yüzde mutasyon oranını hesaplar. </li><li> Ta jel ile saflaştırılmıştır sınırlama enzimi dirençli mutant bandını klonlamak ve klonlar, dizileme ile mutant alleli dizisini belirlemek. <ol><li> Jel kısıtlama üreticinin talimatlarına aşağıdaki dirençli mutant bant enzim arındırmak. TA üreticinin talimatlarına aşağıdaki bant klonlamak. koloniler ve çalkalama 37 ° C&#39;de 1.5 ml LB O / N büyümekinkübatör. </li><li> Üreticinin talimatları izleyerek Miniprep kültürleri. sıralaması için DNA gönder. </li><li> Böyle maymun gibi bir program kullanarak, vahşi tip dizisine mutant dizileri aynı hizaya getirin. <ol><li> Kopyala ve APE dosyaları içine de dizileri yapıştırın. &quot;Araçlar&quot; menüsünden &quot;Align İki Diziler&quot; aracını seçin. </li><li> Açılır menüleri kullanarak iki DNA dizilerini belirtin. Not: klonlanmış dizinin ters tamamlayıcı PCR klonlama vektörü içine çıktı yönüne bağlı olarak kullanılabilir gerekebilir. dizileri hizalamak yoksa, &quot;Align DNA&quot; kutusuna &quot;Rev-Com&quot; kutusunu işaretleyerek adımları tekrarlayın. </li></ol></li></ol></li><li> Uygun aşamada fenotipleri ve beklenen fenotip 29 için uygun yöntemler (Örneğin, Şekil 3) kullanarak kurucu balık değerlendirin. fenotipleme yöntemleri protoc kullanılarak araştırmacı tarafından hedeflenen gen için beklenen fenotipin dayanacaktırol. </li></ol> Germline İletimi için 6. Ekran Not: A. mexicanustan 4-8 ayda cinsel olgunluğa erişirler. <ol><li> vahşi tip balık cinsel olgunluğa kurucu balık çapraz. </li><li> Ekran embriyolar veya adımlar 5,1-5,7 yöntemleri kullanarak yetişkin balık (Şekil 4). Yetişkin balıklar için, kuyruk parçası anesthetization aşağıdaki kesilebilir. <ol><li> fin kırpma sırasında baskıyı azaltmak için tricaine (3-aminobenzoik asit etil ester) içindeki bir çözeltisi içinde balık daldırarak balık anestezisi. fin kırpma ardından, balık taze suya kurtarmak için izin verir. Balık hızla kurtarmak; onlar (normalde yüzme) iyileşene kadar gözleyin. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Büyük adımlar özelliklerin evrim genetik temelini anlamaya yönelik son yıllarda yapılmıştır. Özellikleri, bir dizi evrimi yatan aday gen belirlenmişse de, bunun nedeni en evrimsel ilginç türlerinin genetik tractability eksikliği, in vivo olarak, bu genlerin test etmek zor kalmıştır. Burada A. genom düzenleme için bir yöntem raporu mexicanustan, bir tür mağara hayvanların evrimi incelemek için kullandı. Genetik haritalama 1,21,23 çalışmaları ve aday gen ...

Sürekli evrim genetik temelini anlamak evrimci biyologların kritik bir araştırma hedeftir. Önemli ilerleme özelliklerin evrimini altında yatan lokusların belirlenmesi ve (örneğin 1-3) bu loci içinde aday genlerin saptayarak yapılmamıştır. Ancak, fonksiyonel bu genlerin rolü özelliklerin evrimini incelemek için kullanılan birçok organizmaları zorlu kaldı etmiştir test şu anda genetik uysal değildir. Genom düzenleme teknolojileri çıkması büyük ölçüde organizmaların geniş bir genetik uygulanabılirliği artmıştır. Transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) ve kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmişlerdir kısa yineleyen tekrarlar (CRISPRs) (Örnek 4-11 için) organizmadan genler hedefli mutasyon üretmek için kullanılmıştır. Bir evrimsel ilgili sisteme uygulanan bu araçları, evrimsel biyologlar evrimin genetik temeli çalışma yol devrim potansiyeline sahip. Astyanax mexicanustan iki şekilde bulunur balık türüdür. Bir nehir yaşayan yüzey formu (yüzey balık) ve çoklu mağaralarda yaşayan formları (cavefish) A. mexicanustan cavefish (12 gözden) yüzey balık atalarından evrimleştiği. Cavefish popülasyonu gibi okullaşma davranışının kaybı, artan saldırganlık, duruş ve hiperfajya 13 beslenme değişiklikleri gibi davranış damak tadınızı ve kafatası neuromasts ve değişikliklerin sayısında artış, azalma ya da pigmentasyon kaybı, gözlerde kaybı da dahil olmak üzere özellikleri bir dizi geliştiğini -19. Cavefish ve yüzey balıkları interfertile, ve genetik haritalama deneyleri mağara özellikleri 1,20-26 için lokus ve aday genleri tanımlamak için yapılmıştır. Bazı aday genler diğer türlerin 21 model organizmalarda veya aşırı ifadesinin 27 veya geçici demonte u tarafından, hücre kültürü 1,19 mağara özellikleri katkıda işlevsel rolü için test edilmiştirA. morpholinos 28 şarkı mexicanustan. Bununla birlikte, bu yöntemlerin her biri, bir sınırlama vardır. A. Bu genlerin mutant alelleri oluşturma yeteneği mexicanustan cavefish evriminde işlevini anlamak için kritik önem taşır. Bu nedenle, A. mexicanustan genom düzenleme teknolojileri uygulanması için ideal bir aday organizmadır. Burada A. genom düzenleme için bir yöntem özetlemektedir mexicanustan Talens kullanılmıştır. Bu yöntem, fenotip ve ilgi 29 genlerin kararlı mutasyonları ile balık hatları izole etmek için mozaik enjekte kurucu balık değerlendirmek için de kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection station</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel apparatus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Note: As far as we know, supplies from different companies can be used unless otherwise indicated</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (Granulated)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 in 50% EtOH</td><td>Teknova (ordered through Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin Dihydrochloride, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Ampicillin (1,000x solution)</td><td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal Solution, ready-to-use</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bsa&lt;/em&gt;I</td><td>New England Biolabs (ordered through Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Use BsaI, not BsaI-HF (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>provided with restriction enzymes</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 ligase buffer</td><td>Promega (ordered through Fisher)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (ordered through Fisher)</td><td>PRM7123</td><td>Other Taq can be used, but the reaction should be adjusted accordingly</td></tr><tr><td>Quick ligation kit</td><td>New England Biolabs (ordered through Fisher)</td><td>50-811-728</td><td>We use Quick Ligase for all TALEN assembly reactions</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Chemically Competent E.coli</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>Other chemically competent cells or homemade competent cells can be used</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Esp&lt;/em&gt; 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (Ordered through Fisher)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid-Safe ATP-dependent DNase</td><td>Epicentre (Ordered through Fisher)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>The Qiagen kit should be used for the initial plasmid preparation (as described in the Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit protocol)</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sac&lt;/em&gt; I</td><td>Promega (Ordered through Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&amp;nbsp;</td><td>Ambion (ordered through Fisher)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (ordered through Fisher)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Disposable Soda-Lime Glass Pasteur Pipets</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf (ordered through Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

genome editing in astyanax mexicanus using transcription activator-like effector nucleases (talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

TALEN çifti enjeksiyonlar (NHEJ) birleştiren homolog olmayan uç boyunca tamir edilebilir iki iplikçikli sonları 39 ile sonuçlanan, dolayısıyla Foki etki dimerizasyonunu spesifik DNA nükleotidini RVDs bağlanması ve sonuçlanır. NHEJ sık sık ekleme veya çıkarma (indeller) neden hataları tanıttı. Indeller TALEN hedef bölgesini çevreleyen bölgenin amplifiye edilmesi ve TALEN aralayıcı bölge içinde kesen bir sınırlama enzimi ile elde edilen ampl...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs at JoVE.com

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gen hedefleme mutajenez genom düzenleme teknikleri kullanılarak organizmaların geniş bir mümkündür. Burada, Astyanax mexicanus, yüzey balık ve cavefish içeren balık türlerinin efektör nükleazlar (Talens) gibi transkripsiyon aktivatörü kullanılarak hedeflenen gen mutasyon için bir protokol göstermektedir.

genom Düzenleme<em&gt; Astyanax mexicanustan</emKullanma&gt; Transkripsiyon Aktivatör benzeri Efektör Nükleazlar (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

genome-editing-astyanax-mexicanus-using-transcription-activator-like

Research

JoVE Journal

Biology

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

8.2K Görüntüleme.  Iowa State University.  Gen hedefleme mutajenez genom düzenleme teknikleri kullanılarak organizmaların geniş bir mümkündür. Burada, Astyanax mexicanus, yüzey balık ve cavefish içeren balık türlerinin efektör nükleazlar (Talens) gibi transkripsiyon aktivatörü kullanılarak hedeflenen gen mutasyon için bir protokol göstermektedir. 

Video: Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Genetik

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

CAS9 protein-gRNA kompleksleri Electroporation yoluyla Axolotl omurilik nöral kök hücrelerinin doğrudan gen Knock-Out

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been harnessed by researchers to study important biologically relevant problems. The unparalleled power of the CRISPR/Cas genome editing method allows researchers to precisely edit any locus of their choosing, thereby facilitating an increased understanding of gene function. Several methods for editing the C. elegans genome by CRISPR/Cas9 have been described previously. Here, we discuss and demonstrate a method which utilizes in vitro assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. Specifically, in this article, we go through the step-by-step process of introducing premature stop codons into the C. elegans rbm-3.2 gene by homology-directed repair using this method of CRISPR/Cas9 editing. This relatively simple editing method can be used to study the function of any gene of interest and allows for the generation of homozygous-edited C. elegans by CRISPR/Cas9 editing&#160;in less than two weeks.

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

The goal of this protocol is to enable seamless CRISPR/Cas9 editing of the C. elegans genome using assembled ribonucleoprotein complexes and the dpy-10 co-CRISPR marker for screening. This protocol can be used to make a variety of genetic modifications in C. elegans including insertions, deletions, gene replacements and codon substitutions.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

Genom düzenleyerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için etkili bir strateji

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Gelişim Biyolojisi

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of genes. Prior research into this emerging model system capitalized on comprehensive genome-wide investigations that have identified numerous quantitative trait loci (QTL) associated with various cave-associated phenotypes. However, the ability to connect genes of interest to the heritable basis for phenotypic change remains a significant challenge. One technique that can facilitate deeper understanding of the role of development in troglomorphic evolution is whole-mount in situ hybridization. This technique can be implemented to directly compare gene expression between cave- and surface-dwelling forms, nominate candidate genes underlying established QTL, identify genes of interest from next-generation sequencing studies, or develop other discovery-based approaches. In this report, we present a simple protocol, supported by a flexible checklist, that can be widely adapted for use well beyond the presented study system. It is hoped that this protocol can serve as a broad resource for the Astyanax community and beyond.

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

This protocol enables visualization of gene expression in embryonic Astyanax cavefish. This approach has been developed with the goal of maximizing gene expression signal, while minimizing non-specific background staining.

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Biyoloji

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish species is that it possesses interfertile cave and river-dwelling populations. This enables the genetic mapping of heritable traits that were fixed during adaptation to the different environments of these populations. While this species can be maintained and bred in the lab, it is challenging to both obtain embryos during the daytime and create hybrid embryos between strains. In vitro fertilization (IVF) has been used with a variety of different model organisms to successfully and repeatedly breed animals in the lab. In this protocol, we show how, by acclimatizing A. mexicanus to different light cycles coupled with changes in water temperature, we can shift breeding cycles to a chosen time of the day. Subsequently, we show how to identify suitable parental fish, collect healthy gametes from males and females, and produce viable offspring using IVF. This enables related procedures such as the injection of genetic constructs or developmental analysis to occur during normal working hours. Furthermore, this technique can be used to create hybrids between the cave and surface-dwelling populations, and thereby enable the study of the genetic basis of phenotypic adaptations to different environments.

Gamete Collection and In Vitro Fertilization of Astyanax mexicanus

In vitro fertilization is a commonly used technique with a variety of model organisms to maintain lab populations and produce synchronized embryos for downstream applications. Here, we present a protocol that implements this technique for different populations of the Mexican tetra fish, Astyanax mexicanus.

Gamete koleksiyonu ve Astyanax mexicanus In vitro fertilizasyon

Astyanax mexicanus is emerging as a model organism for a variety of research fields in biological science. Part of the recent success of this teleost fish ...

Genome Editing

A well-established technique for modifying specific sequences in the genome is gene targeting by homologous recombination, but this method can be laborious and only works in certain organisms. Recent advances have led to the development of &#8220;genome editing&#8221;, which works by inducing double-strand breaks in DNA using engineered nuclease enzymes guided to target genomic sites by either proteins or RNAs that recognize specific sequences. When a cell attempts to repair this damage, mutations can be introduced into the targeted DNA region. In this video, JoVE explains the principles behind genome editing, emphasizing how this technique relates to DNA repair mechanisms. Then, three major genome editing methods&#8212;zinc finger nucleases, TALENs, and the CRISPR-Cas9 system&#8212;are reviewed, followed by a protocol for using CRISPR to create targeted genetic changes in mammalian cells. Finally, we discuss some current research that applies genome editing to alter the genetic material in model organisms or cultured cells.

genom Düzenleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler