DF NSF Köprüler Doktora bursu tarafından desteklenmektedir. Bu çalışmada kullanılan mikroskop Colorado State Üniversitesi Mikroskop Görüntüleme Ağ temel altyapı hibe tarafından kısmen desteklenmektedir. İş yazarı s laboratuvarda clathrin adaptörleri CSU start-up fonları ve SD Amerikan Kalp Derneği ödül 09SDG2280525 tarafından desteklenmektedir

1. SLA1 gen, GFP etiketi ve seçilebilir işaretleyici Incorporation Doğrudan bir GFP etiketi SLA1 gen açık okuma çerçevesi 3 &#39;sonunda (Sla1p C-terminalindeki) sigorta ve gen E. ile eş zamanlı olarak işaretlemek için 17 Longtine yöntemi uygulayın G418 seçimini sağlar coli kan r gen. <ol><li> Ileri, bir şablon olarak plazmid pFA6a-GFP (S65T) kanMX6 18 ve aşağıdaki primerler kullanılarak PCR ile DNA parçası oluşturun: 5&#39;-CA AGG CAA GCC AAC ATA TTC AAT GCT ACT GCA TCA AAT CCG TTT GGA TTC CGG ATC CCC GGG TTA ATT AA-3 &#39;, ve tersine, 5&#39;-CA TAT AGC TTG TTT TAG TTA TTA TTK TAT AAA ATC TTA AAA TAC ATT AAT GAA TTC GAG CTC GTT TAA AC-3&#39;. Altı çizili dizisi SLA1 gen belirli bir kesimi hemen önceki (ileri astar) ve stop kodon (ters astar) karşılık gelir. PCR ürünü agaroz jel elektroforezi DNA arıtma ayırın. </li><li> S. 50 ml kültür hazırlayın cerevisiae SEY6210 suşu (MAΤα ura3-52, leu2-3, 112 his3-Δ200, trp1-Δ901 lys2-801, suc2-Δ9 GAL-MEL) (19) YPD, erken logaritmik faz (OD 600 = 0,2-0,6) büyüyor. 2.000 xg&#39;de 3 dakika oda sıcaklığında Spin, iki kez steril su ile yıkayın. </li><li> Lityum asetat prosedürü kullanarak 20 hücre içine 1. adımda elde edilen PCR parçası Transform. 1 ml YPD ve 30 az 4 saat süreyle inkübe ° C ile sallama eklemek hücreler, 1 ml steril su ile yıkayın. </li><li> YPD-G418, G418-dirençli transformants, 2-3 gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe seçmek için plakalar üzerinde hücrelerinin yayılmasını. YPD-G418 plakaları koloniler ve çizgi onları seçin. </li><li> Kullanarak koloni-PCR, GFP-kan modülü düzgün homolog rekombinasyon SLA1 gen sekansları ile entegre edildiği transformants tanımlar. Ileri bir astar kullanın SLA1 açık okuma çerçevesi ve ters astar içinde tavlarıdır GFP-kan modülü içinde tavlarıdır. PCR ürünlerinin beklenen bir boyutu var ve sıralama ile doğrulamak koloniler belirleyin. </li><li> GFP floresan onaylamak için floresan mikroskobu ile koloniler Ekran. </li></ol> 2. Varyant clathrin kutusu (VCB) SLA1 geninde mutasyon <ol><li> Iki aşamalı bir yaklaşım 15 SLA1 geni (nükleotidler 2407-2415) AAALQ mutasyon LLDLQ tanıtın. </li><li> İlk olarak, SLA1 nükleotidler PCR ile 1207-1410 ve 2427-2589 yükseltmek ve sırasıyla pBluescriptKS Noti / BamHI ve EcoRI / Sali sitelerine parçaları klonu. </li><li> BamHI / EcoRI siteleri URA3 içeren bir PCR parçası haline Subclone. </li><li> Cleave Noti / Sali ile sonuçlanan plazmid, jel arıtma URA3 parçası izole ve Bölüm 1 ya da TVY614 (Mata ura3-52 leu2 3112 his3 Δ200 trp1 içine oluşturulan Sla1-GFP gerginlik içine lityum asetat dönüşümü ile tanıtmak Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 pep4: LEU2 prb1: HISG prc1: HIS3) 21. </li><li> Urasil eksik tamamlanan SD plakalar üzerinde hücrelerinin yayılmasını. Koloni-PCR ile onaylayın ve sıralama Ura + koloniler VCB parçası yerine düzgün bir şekilde entegre URA3 içerir. </li><li> İkinci adımda ise, subclone SLA1 nükleotidler pBluescriptKS Noti / Sali sitelerine 1207-2589. QuickChange-XL siteye yönlendirilmiş mutasyon kiti (Stratagene), AAALQ VCB artıkları LLDLQ mutasyona. Sıralama tarafından olun. </li><li> Cleave BsgI / AgeI ile inşa ve mutant VCB parçasını içeren jel arıtma izole. Bölüm 2.3 &#39;de elde edilen gerginlik içine pRS313 (HIS3) 22 BsgI / AgeI parçası Cotransform. </li><li> Histidin eksik tamamlanan SD plakalar üzerinde hücrelerinin yayılmasını. Mutant dizileri yenileyici, böylece AAALQ mutasyon (sla1 AAA) LLDLQ içeren sla1 gen URA3 yerine hücreleri tespit etmek 5-fluorotic asit içeren agar üzerine Replica plakalı Onun + koloniler. Koloni-PCR ve sıralama ile onaylayın. </li></ol> 3. Floresan mikroskopi <ol><li> Maya suşları bir OD 600 = 0.1-0.4 ulaşana kadar tamamlanan SD medya 4 ml 30 Bölüm 1 ve 2 ° C karanlık bir rotator Sla1-GFP ve sla1 AAA-GFP büyütün. Oda sıcaklığında 1 dakika için 4.000 xg&#39;de mikrosantrifüj kültür 1ml Spin. Süpernatant ~ 950 ul atın. Kalan sıvı (~ 50 ul) hücreler tekrar </li><li> Mevduat 3 mikroskobu slayt üzerine hücre süspansiyonu ul ve cam lamel ile kaplayın. Örnek ışıktan koruyun. </li><li> Mount dönen bir disk konfokal mikroskop 100x yağ daldırma amacı kaydırın. </li><li> GFP ile floresan heyecanlandırmak ve tespit etmek için uygun filtreler ile aydınlık aydınlatma veya 488 nm lazer kullanarak hücrelerin doğru odak düzlemli bulun. </li><li> Maruz kalma süresi 500 ms (veya uygun değeri) hücrelerinde Sla1-GFP ve sla1 AAA-GFP zaman atlamalı görüntüler yakalayınn 150 saniye boyunca saniyede bir görüntü aralığı. Beklenen sonuç: sinyal hızla kaybolur olarak GFP etiketli punctae, hücre zarı sınırlayan iç yüzeyinde görünür birkaç saniye boyunca devam ve hücrenin merkezine doğru hareket (demontaj kat belirten). </li><li> Noktalar görünmesi, birkaç saniye kalır ve yok olan bir resmin bir bölümünü seçin. Zaman atlamalı görüntüleri her bir çerçeve için görüntü bu bölümünde kırpın. </li><li> Temsil eden bir görüntü bu bölümünde 150 saniyelik zaman atlamalı görüntü, her çerçeve içinde geçen zaman karşılık gelen bir eksen boyunca kare hizalayarak kymograph oluşturun. </li><li> (Time-lapse kare) noktalar kymograph kaç saniye dayanan her noktanın süresini hesaplayın. Not her yerinde ceket endositoz ve demontaj yansıtan yok gibi hücrenin içine doğru &quot;eğrisi&quot;. </li><li> Vahşi tip Sla1-GFP sla1 AAA-GFP ile karşılaştırın. Sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için tekrarlayın. Beklenen sonuç: sla1 AAA-GFP noktalar (~ 80 sn) 15 kat oluşumu bir kusur gösteren vahşi tip (~ 30 sn) daha uzun süre önemli ölçüde devam etmektedir. </li></ol> 4. Maya sitozolik özü ve toplam hücre özü hazırlanması <ol><li> TVY614 21 gibi uygun bir maya suşu, YPD 3 litre İnokülasyon ve 30 büyümeye çalkalayıcı inkübatör ° C OD 600 = 1-2 ulaşana kadar. </li><li> 3.700 x g 20 dakika oda sıcaklığında maya kültürü santrifüjleyin. Süpernatantı atın, 3-5 ml steril su ekleyin ve pelet tamamen yeniden süspanse kadar pipet ve aşağı. </li><li> ~ 150 ml, 250 ml plastik beher, sıvı nitrojen dökün. Flash dondurma dondurulmuş pelet aglütinasyon önlemek için, dairesel bir kalıp içinde sıvı azot içine damla damla ekleyerek maya. Gerekirse daha fazla sıvı azot, pelet çözülme izin vermeyin. </li><li> Paslanmaz çelik blender kabı içinde sıvı azot dökerek soğutun. Sıvı azot neredeyse tamamen buharlaşması için izin verin. Soğuk blender kabı dondurulmuş maya pelet ekleyin. Blender kabı soğuk bir lastik tıpa ile kapatın ve 10 saniye boyunca maya pelet eziyet. Içeriğini karıştırın ve iki kez taşlama adımı tekrarlayın konteyner 3-4 kez ters çevirin. Zemin dondurulmuş maya, toz gibi bir görünüme sahip. </li><li> Sıvı nitrojen ile bir huni ve 50 ml konik tüp soğutun. Soğuk bir huni kullanarak, zemin maya tüp transferi. Donmuş toprak maya -80 ° C veya hemen kullanılmalıdır mağaza olabilir. </li><li> GST-füzyon protein yakınlık assay (Bölüm 5), ağırlığı 3 g donmuş zemin TVY614 maya 15 ml konik bir tüp içinde ve oda sıcaklığında tampon 3 ml tekrar süspansiyon için sitozolik özü elde etmek için A (10 mM HEPES, pH 7.0, proteaz inhibitörü kokteyli (Sigma) içeren 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). </li><li> Cap ve tüp tamamen çözülmüş ve ardından buz üzerine oturtacak kadar birkaç kez ters. </li><li> 4 özü ultrasantrifüjdeki ° C az 20 dakika süreyle 300.000 x g. Dikkatle pelet bozmadan bir pipet kullanarak konik bir tüp supernatant (sitozolik ekstresi) aktarın. Sitozolik özü buz üzerinde tutun. </li><li> Boncuklar pipeting kolaylaştırmak amacıyla, ucu sonu kesmek için uygun bir tampon A&#39;da% 50 (v / v) glutatyon-sepharose bulamaç 100 ul ekleyin. 4 Döndür ° C 15 dakika, spin-aşağı 4 santrifüj boncuk ° C 2 dk, 1000 xg&#39;de ve taze bir tüp supernatant (sitozolik ekstresi) aktarmak. Rezerv 50 ul giriş kontrolü için özü. </li><li> Co-immunoprecipitation deneyler için toplam hücre özleri (Part 6) elde etmek için, gerginlik TVY614 (WT SLA1), bir LLDLQ Bölüm 2, TVY614 arka planda oluşturulan AAALQ mutasyon taşıyan sla1 AAA gerginlik ve silme taşıyan bir sla1 gerginlik GPY3130 23 gibi SLA1 gen. Ağırlık 2 g konik tüpler ilgili donmuş zemin maya ve oda sıcaklığında tampon 2 ml onları tekrar süspansiyon, proteaz inhibitörü kokteyl (Sigma) ve% 2 Triton X-100 içeren. </li><li> Cap ve tüpü birkaç kez ters tamamen çözülmüş ve daha sonra periyodik olarak tersine çevirerek karıştırma, 10 dakika kadar buz üzerinde inkübe. </li><li> 4 mikrosantrifüj tüpleri ve spin malzeme transferi ° C 15 dakika 16.000 xg (mikrosantrifüj üst hız). Dikkatle pelet rahatsız olmadan bir pipet kullanarak buz üzerinde konik bir tüp supernatant (toplam hücre özü) transferi. </li><li> 4 Döndür tampon A&#39;da% 50 (v / v) protein, A-sepharose bulamaç 100 ul ° aşağı spin-C, 15 dakika santrifüj yoluyla boncuk, 4 ° C ve 1000 xg&#39;de 2 dk transferi supernatant (toplam ekstresi) taze bir tüp. Rezerv 50 ul giriş kontrolü için özü. </li></ol> 5. GST-füzyon proteini yakınlık tahlil <ol><li> PCR bir parçası containi tarafından Amplifyng Sla1p varyant clathrin-box (VCB) (artıkları 803-807), pGEX 5X-VCB elde etmek için pGEX-5X içine klonu. Sıralama tarafından olun. </li><li> PGEX-5X-VCB bir şablon olarak kullanma ve QuickChange-XL mutasyon kiti (Stratagene) site, pGEX 5X-vCBmut elde etmek için AAALQ VCB artıkları LLDLQ mutasyona. Sıralama tarafından olun. </li><li> Hızlı GST ve füzyon proteinleri ve GST-VCB ve E. GST-vCBmut coli (BL21 de3), glutatyon-sepharose, Zehir indirgenmiş glutatyon ile boncuklar kullanarak arındırmak, PBS karşı dialyze ve protein konsantrasyonu belirlemek. </li><li> Etiket 3 mikrosantrifüj borular: GST, GST-VCB ve GST-vCBmut ve 1 ml PBS, tampon% 50 (v / v) glutatyon-sepharose bulamaç 30 ul dialized GST, GST, ve 50 mikrogram eklemek VCB ya da GST-vCBmut füzyon proteinleri. </li><li> Bağlama için izin oda sıcaklığında 30 dakika çevirin. </li><li> Bölüm 4 açıklandığı gibi hazırlanmış - Her tüpe 1 ml, maya sitozolik özü tampon A. ile boncuk PBS ile 2 kez ve 1 kez yıkayın. </li><li> 5.000 pelet boncuk için xg tüpler 1 saat 4 ° C, spin 10 sn Döndür supernatant atmak ve hızlı bir şekilde tampon A. ile tampon boncuklar içeren% 0.1 Triton X-100 ve 1 kez 3 kere yıkayın </li><li> Bir kez daha ve bir jel yükleme ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla sıvı olarak kaldırmak boncuk aşağı spin. Bu noktada, daha sonraki bir zamanda devam örnekleri -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> 96 ° C &#39;de 5 dakika inkübe her tüp, 2x Laemmli örnek tampon 15 ul ekleyin ve 5.000 x g. az 10 sn Spin </li><li> Clathrin ağır zincir antikor kullanarak immün örnekleri analiz edin. Beklenen sonuçlar: clathrin değil GST veya GST-vCBmut GST-VCB bağlanır. Ayrıca numunelerin GST füzyon proteinleri benzer yükleme onaylamak için SDS-PAGE ile analiz. </li></ol> 6. Co-immunoprecipitation tahlil <ol><li> Etiket 3 mikrosantrifüj borular: WT (yabani tip SLA1), sla1 AAA ve sla1Δ ve PBS 1 ml, 30 ul tampon A-sepharose bulamacı% 50 (v / v) protein, A, ve 2 mikrogram eklemek tavşan anti-Sla1p antikor. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika çevirin. </li><li> Boncuklar tampon A içeren% 1 Triton X-100 ve 1 kez PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> SLA1 sla1 AAA ve sla1Δ: Bölüm 4 hazırlanan karşılık gelen toplam maya özleri 1 ml ekleyin. 1 saat 4 ° C döndürmek </li><li> Spin 10 sn 5.000 pelet boncuk xg supernatant atmak ve hızlı bir şekilde boncuklar tamponu ile 3 kere yıkayın A içeren% 0.1 Triton X-100 ve 1 kez tampon A. </li><li> Bir kez daha ve bir jel yükleme ucu kullanarak mümkün olduğunca fazla sıvı olarak kaldırmak boncuk aşağı spin. Bu noktada, daha sonraki bir zamanda devam örnekleri -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> 96 ° C &#39;de 5 dakika inkübe her tüp, 2x Laemmli örnek tampon 15 ul ekleyin ve 5.000 x g. az 10 sn Spin </li><li> Clathrin ağır zincir antikor kullanarak immün örnekleri analiz edin. Beklenen sonuçlar: clathrin sla1 AAA veya sla1Δ örnek değil, vahşi tip Sla1p birlikte immunoprecipitates. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 canlı hücre floresan mikroskobu ile endositik siteler Sla1p clathrin adaptörü Analizi. Bir çerçeve (sol), Sla1-GFP veya bir LLDLQ AAALQ mutasyonu taşıyan sla1 AAA-GFP ifade maya hücreleri bir video ve buna karşılık gelen kymographs (sağda) . Yabani tip ve mutant Sla1-GFP endojen SLA1 lokus ifade edildi. Endositik siteler hücre çevre (sol görüntü) dağıtılan parlak noktalar olarak görülmektedir. Beyaz çizgiler arasındaki alanda, hangi kymographs oluşturulan bölgeye karşılık gelir. Filmler 1 kare / sn &#39;lik bir kare hızında alınmıştır. AAALQ mutant (sla1 AAA) LLDLQ vahşi tip (SLA1) ile karşılaştırıldığında daha uzun kullanım ömrü Sla1-GFP dikkat edin. <img src="/files/ftp_upload/2352/2352fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 clathrin ve Sla1p varyant clathrin kutusu arasındaki fiziksel etkileşim. GST glutatyon-sepharose boncuklar bağlanır ve vahşi bir sitozolik ekstresi ile inkübe edildi dizisi LLDLQ (GST-VCB), ilgili AAALQ mutant (GST-vCBmut), ya da GST tek başına (GST) içeren parçası aa798-813 Sla1p erimiş tip maya hücreleri. Ilişkili proteinler clathrin ağır zincir (IB) immün yıkandı, ve analiz edildi.

<ol>
	<li>Mellman, I., Warren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+taken:+past+and+future+foundations+of+membrane+traffic.">The road taken: past and future foundations of membrane traffic.</a> Cell. 100, 99-112 (2000).</li><li>Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+assembly+and+endocytosis:+from+yeast+to+mammals.">Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).</li><li>Conner, S. D., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+portals+of+entry+into+the+cell.">Regulated portals of entry into the cell.</a> Nature. 422, 37-44 (2003).</li><li>Bonifacino, J. S., Traub, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+for+sorting+of+transmembrane+proteins+to+endosomes+and+lysosomes.">Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes.</a> Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).</li><li>Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis:+clathrin-mediated+membrane+budding.">Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding.</a> Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).</li><li>Doherty, G. J., McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+endocytosis.">Mechanisms of endocytosis.</a> Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).</li><li>Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin.">Clathrin.</a> Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).</li><li>Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+basket+weaving:+formation+and+function+of+clathrin-coated+vesicles.">Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).</li><li>Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptors+for+clathrin+coats:+structure+and+function.">Adaptors for clathrin coats: structure and function.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).</li><li>Dell'Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+AP-3+adaptor+complex+with+clathrin.">Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin.</a> Science. 280, 431-434 (1998).</li><li>Dell'Angelica, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-binding+proteins:+got+a+motif?+Join+the+network!.">Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network!.</a> Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).</li><li>Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic-lethal+interactions+identify+two+novel+genes,+SLA1+and+SLA2,+that+control+membrane+cytoskeleton+assembly+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).</li><li>Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sla1p+serves+as+the+targeting+signal+recognition+factor+for+NPFX(1,2)D-mediated+endocytosis.">Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis.</a> J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).</li><li>Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i., Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Sla1p+homology+domain+1+and+interaction+with+the+NPFxD+endocytic+internalization+motif.">Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif.</a> EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).</li><li>Pietro, S. M. D. i., Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+clathrin+adaptor+function+in+endocytosis:+A+novel+role+for+the+SAM+domain.">Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain.</a> EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).</li><li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+design+for+the+clathrin-+and+actin-mediated+endocytosis+machinery.">A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery.</a> Cell. 123, 305-320 (2005).</li><li>Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14, 953-9561 (1998).</li><li>Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+HIS3+marker+and+GFP+reporter+modules+for+PCR-targeting+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 13, 1065-1075 (1997).</li><li>Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+sorting+in+Saccharomyces+cerevisiae:+isolation+of+mutants+defective+in+the+delivery+and+processing+of+multiple+vacuolar+hydrolases.">Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases.</a> Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).</li><li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations.">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).</li><li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast.">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li><li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122, 19-27 (1989).</li><li>Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPFXD-mediated+endocytosis+is+required+for+polarity+and+function+of+a+yeast+cell+wall+stress+sensor.">NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor.</a> Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).</li></ol>

Clathrin kaplı vezikül (CCV) trans Golgi ağından endositoz ve ulaşım katılmak ve ökaryotik hücre biyolojisi için temel korunmuş yollar endosomes. Bu yöntem kağıt açıklanan yaklaşımlar, adaptör proteinler ve clathrin arasındaki etkileşimler, CCV oluşumu için sorumlu olan moleküler mekanizmalar çalışma yararlıdır. GST-füzyon proteini yakınlık ve ortak immunoprecipitation deneyleri bir adaptör (aday) ve clathrin arasındaki fiziksel ilişki test izin verir. GFP-etiketleme ve flores...

<table border="1"><th> Malzeme </th><th> Şirket </th><tbody><tr><td> QuickChange-XL site directed mutagenesis kiti </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> proteaz inhibitörü kokteyl </td><td> Sigma </td></tr></tbody></table>

in vivo and in vitro studies of adaptor-clathrin interaction

Büyük bir endositik yolu taşıma kargo hücre yüzeyinden 1-6 endosomes clathrin kaplı vezikül (CCVs) oluşumunu başlatır. CCVs clathrin kat vezikül membran yüzlü bir kafes seçkin ve mekanik bir iskele olarak hizmet vermektedir. Clathrin kat bireysel clathrin triskelia, üç üç ağır ve hafif zincir alt birimden 7,8 oluşan clathrin çözünür formu vezikül oluşumu sırasında monte edilir. Triskelion doğrudan membran bağlama yeteneği olmadığından, clathrin bağlayıcı adaptörler, lipidler ve / veya membran proteinlerinin 9 dernek aracılığıyla membran oluşturan clathrin kafes bağlamak için kritik öneme sahiptir . Adaptörler ayrıca paket transmembran protein bu reseptörler olarak kargo, ve birbirleri ile ve diğer bileşenleri ile CCV, makine 9 etkileşimde bulunabilirsiniz. Clathrin adaptörler, yirminin üzerinde tanımlanmıştır birçok clathrin aracılı endositoz katılan ve diğerleri trans Golgi ağa lokalize veya 9 endosomes. HIP1R (maya Sla2p) hariç, tüm bilinen clathrin adaptörleri clathrin ağır zincir 9 N-terminal-pervane etki alanına bağlanır. Clathrin adaptörleri yapılandırılmamış esnek linkers bağlı katlanmış etki oluşan modüler proteinlerdir. Bu ilintileyiciniz bölgeler içinde, kısa bağlayıcı motifleri clathrin vezikül oluşumu makine 9 N-terminal etki alanı veya diğer bileşenler ile etkileşimleri arabuluculuk . İki ayrı clathrin bağlayıcı motifleri tarif edilmiştir: clathrin kutusu ve W-box 9. Konsensus clathrin kutu dizisi ilk olarak tanımlandı L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 varyantları daha sonra 11 keşfedilen edilmiştir. W-box dizisi PWxxW (x herhangi bir kalıntı olduğu) için uygundur. Sla1p (Cehennem Aktin bağlayıcı protein-1 Sentetik), aslında bir aktin ilişkili protein olarak tanımlanan ve maya hücreleri 12 endositik sitelerinde normal aktin hücre iskeletinin yapısı ve dinamikleri için gerekli oldu . Sla1p NPFxD endositik sıralama sinyali bağlanır ve NPFxD sinyal 13,14 taşıyan kargo endositoz için kritik öneme sahiptir. Daha yakın zamanlarda, Sla1p clathrin kutusu, LLDLQ benzer bir motif ile clathrin bağlamak gösterildi, bir varyant clathrin-box (VCB) olarak adlandırılan ve 15 endositik clathrin bir adaptör olarak işlev. Buna ek olarak, Sla1p endositik canlı hücre floresan mikroskop çalışmaları 16 kat için yaygın olarak kullanılan bir belirteç haline gelmiştir. Burada adaptörü clathrin etkileşim çalışmaları için yaklaşımları tanımlamak için bir model olarak Sla1p kullanabilirsiniz. Biz canlı hücre floresan mikroskopi odaklanmak, aşağı GST-pull ve co-immunoprecipitation yöntemleri.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction at JoVE.com

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin-aracılı endositoz kargo seçimi ve clathrin kat montaj koordine adaptör proteinler bağlıdır. Burada bir model olarak maya endositik adaptör protein Sla1p kullanarak adaptörü clathrin fiziksel etkileşim ve canlı hücre görüntüleme yaklaşımları incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

In vivo ve in vitro Adaptör-clathrin Etkileşim Çalışmaları

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

in-vivo-and-in-vitro-studies-of-adaptor-clathrin-interaction

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

14.4K Görüntüleme.  Colorado State University. Clathrin-aracılı endositoz kargo seçimi ve clathrin kat montaj koordine adaptör proteinler bağlıdır. Burada bir model olarak maya endositik adaptör protein Sla1p kullanarak adaptörü clathrin fiziksel etkileşim ve canlı hücre görüntüleme yaklaşımları incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.

Video: In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Biyoloji

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

Sitoplazmik DNA Algılama Pathways uyarılması<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

Fare Matrix Jel Plug Test kullanma İnsan endotel-pericyte Etkileşim Vivo Çalışmasında

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

Vitro ve In Vivo yaklaşımlar Bağırsak epitel hücre geçirgenliği belirlemek için

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

In Vitro E3 Ubiquitin Ligase fonksiyonunun analizi

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

Kardiyak ve Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Yetişkin, Genç, Larva ve Embriyonik Zebra Balıklarından İzolasyonu

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an efficient inducible mechanism to isolate the fungal haustoria from the plant cell protoplast. Conversely, pectin, one of the polymeric components of the cell wall, is a target of several pectolytic enzymes in necrotrophic interactions. Here, a protocol to detect pectin and fungal hyphae through optical microscopy is presented. The pectin-rich encapsulation in the cells of coffee leaves infected by the rust fungus Hemileia vastatrix and the mesophyll cell wall modification induced by Cercospora coffeicola are investigated. Lesioned leaf samples were fixed with the Karnovsky solution, dehydrated, and embedded in glycol methacrylate for 2-4 days. All steps were followed by vacuum-pumping to remove air in the intercellular spaces and improve the embedding process. The embedded blocks were sectioned into 5-7 &#181;m thick sections, which were deposited on a glass slide covered with water and subsequently heated at 40 &#176;C for 30 min. Next, the slides were double-stained with 5% cotton blue in lactophenol to detect the fungus and 0.05% ruthenium red in water to detect pectin (acidic groups of polyuronic acids of pectin). Fungal haustoria of Hemileia vastatrix were found to be encapsulated by pectin. In coffee cercosporiosis, mesophyll cells exhibited dissolution of cell walls, and intercellular hyphae and conidiophores were observed. The method presented here is effective to detect a pectin-associated response in the plant-fungi interaction.

This protocol describes a microscopical method to detect pectin in coffee-fungus interaction.

Bitki-Mantar Etkileşiminde Pektini Tespit Etmek için Çift Boyama Yöntemi

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; however, there are currently no treatment or therapeutic options for vascular calcification. Calcification begins within specialized extracellular vesicles (EVs), which serve as nucleating foci by aggregating calcium and phosphate ions. This protocol describes methods for obtaining and assessing calcification in murine aortas and analyzing the associated extracted EVs. First, gross dissection of the mouse is performed to collect any relevant organs, such as the kidneys, liver, and lungs. Then, the murine aorta is isolated and excised from the aortic root to the femoral artery. Two to three aortas are then pooled and incubated in a digestive solution before undergoing ultracentrifugation to isolate the EVs of interest. Next, the mineralization potential of the EVs is determined through incubation in a high-phosphate solution and measuring the light absorbance at a wavelength of 340 nm. Finally, collagen hydrogels are used to observe the calcified mineral formation and maturation produced by the EVs in vitro.

Analysis of Extracellular Vesicle-Mediated Vascular Calcification Using In Vitro and In Vivo Models

This paper presents the methodology for obtaining and assessing vascular calcification by isolating murine aortas followed by extracting calcified extracellular vesicles to observe the mineralization potential.

Hücre Dışı Vezikül Aracılı Vasküler Kalsifikasyonun In Vitro ve In Vivo Modeller Kullanılarak Analizi

Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world, and vascular calcification is the most significant predictor of cardiovascular events; ...