Name: lateral root inducible system in arabidopsis and maize
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize at JoVE.com

The authors thank Davy Opdenacker for technical assistance and photography. We greatly thank Dr. Annick Bleys for helpful suggestions to improve the manuscript. This work was financed by the Interuniversity Attraction Poles Programme IUAP P7/29 'MARS' from the Belgian Federal Science Policy Office, by the FWO grant G027313N and by the Agency for Innovation by Science and Technology, IWT (IR).

1. Arabidopsis lris Protokolü Not: Metin &quot;küçük&quot; veya &quot;büyük&quot; ölçekli deneyler anlamına gelir. Bu tür işaret hattı analizi ve histolojik boyama 6, 14 gibi küçük ölçekli deneyler, sadece bir kaç numune gereklidir. Bu tür kantitatif gerçek zamanlı Mah-PCR, mikro-diziler 9-11 veya RNA sıralama gibi büyük ölçekli deneyler, örneklerin büyük bir miktarda gerektirir. Bu nedenle, her örnek için 1000 fide Vanneste ve arkadaşları tarafından kullanılan ~ arasında. 11 bir miktar kök kademeli bir diseksiyon sonra mikrodizi deneyi gerçekleştirmek için. 1.GÜN <ol><li> Arabidopsis tohumları Sterilizasyon Not: Tohum sterilizasyonu için aşağıdaki yöntemlerden birini seçin. Bunlardan herhangi protokol aşağıdaki adımları için uygundur. Gaz sterilizasyonu (1.1.2) sıvı sterilizasyon (1.1.1) üzerinden iki ana avantajı sunuyor: Büyük bir uyuşmuş tutarken daha az zaman alırTohumların er, pipetleme bireysel numuneleri oluşabilir gerektiği için; ve sterilize edilmiş tohumlar, daha uzun bir süre boyunca saklanabilir. Bununla birlikte, bu bir desikatörde ve dikkatli bir şekilde kullanılması gerekmektedir. <ol><li> Sıvı sterilizasyon <ol><li> Mikro-santrifüj tüplerine tohumların istenilen sayıda dökün. 2 ml&#39;lik bir mikro santrifüj tüplerine 1.5 ml bir tüp içinde 20 mg (~ 800 tohumlar) ya da 40 mg (~ 1.600 tohumlar) kadar kullanın. </li><li> % 70 etanol içinde 1 ml ilave edilir. Çevirin ya da hafifçe 2 dakika süreyle çalkalayın. </li><li> 15 dakika boyunca 1 ml sterilizasyon solüsyonu ile% 70 etanol değiştirin. (Taze sterilizasyon çözüm hazırlayın: 3.85 ml sodyum hipoklorit (NaOCl) stok (% 12) (DİKKAT: Kullanım) kaput duman 5 ul Tween 20, su ile 10 ml&#39;ye kadar tüm tohumların gelip emin olmak için boruları birkaç kez ters çevirin. çözeltisi ile temas halinde değildir. </li><li> Tekrarlanan bir laminar hava akış kabini olarak, 5 dakika boyunca tohumlar 5 kez 1 ml steril damıtılmış su ile sterilizasyon solüsyonu yerine ve durulamaly taze, steril damıtılmış su içinde 1 ml değiştirilmesi. </li></ol></li><li> Gaz Sterilizasyon <ol><li> 2 ml mikro santrifüj tüpü içinde tohum istenilen sayıda dökün. Birkaç bağımsız çizgiler ile çalışan tek tek tüpler kullanımı ve bunların plastik bir mikro santrifüj tüplerine ya da kutu yuvasına açılan sağlayabilir. Bir tüp tohum sayısı 500 (12.5 mg) üzerinde ise, başarılı bir sterilizasyon sağlamak için boruların uygun sayıda tohum ayırabiliriz. Komşu tüplerin kapakları birbirine örtmeyen emin olun. O sterilizasyon için de desikatöre olması gerekir gibi alt kutunun kapağını birbirine uygun. </li><li> Bir cam beher ile birlikte bir desikatörde bir kase kutusu yerleştirmek (DİKKAT: kaput duman). </li><li> (: Kullan davlumbaz DİKKAT)% 12 NaOCİ 100 ml beher doldurun. Desikatöre kapağı koymak, ama beher yerleştirilen küçük bir diyafram bırakın. </li><li> (CAU% 37 hidroklorik asit (dumanlı) 3 ml ilave edilirTION: kullan küçük delikten beher kaputu) duman ve hızlı bir şekilde desiccator kapatın. Cl 2-gaz oluşumu nedeniyle bir süredir çözüm olacak kabarcık. Sistemi bırakın O / N (veya en azından 8 saat) kapattı. </li><li> Desikatöre kapağını kaldırın. Kutusunu çıkarın ve taşıma sırasında kontaminasyonu önlemek için kapak ile örtün. </li><li> Bir laminar hava akışı kabini içinde kutu koyun kapağını çıkarın ve gaz çıkışına izin vermek için oda sıcaklığında yaklaşık 1 saat için tohum bırakın. Not: Tohum güvenli bir şekilde 4 ° C &#39;de 2 hafta boyunca, kapalı mikro santrifüj tüplerine kuru saklanabilir. </li></ol></li></ol></li><li> Arabidopsis&#39;te yanal kök indüksiyonu <ol><li> Yanal Kök İnhibisyon (NPA Tedavisi) <ol><li> In vitro büyüme için büyüme ortamı hazırlar. Ortamı, yarı kuvvetli Murashige ve Skoog tuzu karışımını 15, 0,1 g / L miyo-inositol, 10 g / L sakkaroz içeren, ve 0.5 ile tamponlanmıştırg / L 2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES). </li><li> 1 M KOH ile 5.7 pH ayarlayın. Bitki doku agar 8 g / L ilave edin ve 121 ° C &#39;de 20 dakika boyunca ortam otoklav. </li><li> Dimetilsülfoksit (DMSO) (: eldiven kullanın DİKKAT) NPA 25 mM stok çözeltisi hazırlayın. Levhalı bir hava akış kabininde, (şişe elle tutulabilen sıcaklıktır) yaklaşık 65 ° C&#39;ye kadar otoklava ortamın soğutulması ve 10 uM NPA nihai bir konsantrasyon elde etmek için, 25 mM stok çözeltisi NPA ekleyin. </li><li> Yavaşça 10 saniye boyunca şişeyi çalkalayarak eklendikten sonra homojenize. Kare petri tabağı başına ortam 50 ml (12 cm x 12 cm) dökün. Not: Büyük ölçekli deney durumunda, kolay aktarım sağlamak için, bir naylon örgü (20 um) uygulanır. Otoklavlama (Şekil 1A) bir örgü (9 cm x 9 cm) hazırlayın. Otoklavda sterilize edildiği zaman steril cımbız (Şekil 1B) kullanarak büyüme ortamına örgü uygulanır. Yavaşça ste kullanarak büyüme ortamına itmek örgü(: Steril şartlarda çalışmak DİKKAT) büyüme ortamına (Şekil 1B) ile iyi temas olduğundan emin olmak için drigalsky rilized. </li><li> NPA-plakalar üzerinde tohum ekmek. , Durumunda büyük ölçekli deneme planlanmaktadır (1.2.2.3 bakınız) örnekleme kolaylaştırmak için 50 tohum 2 yoğun ve iyi hizalanmış satırları saçmak: Not. <ol><li> Sıvı sterilizasyon durumda, 200 ul pipet kullanılarak NPA-plakalar üzerinde tohumları ekmek. 3 kes - sırayla steril koşullar (ya da ipuçları sterilize edilmeden önce) içinde pipet uçları sonu 4 mm tohumları pipetlemeyin edebilmek için. Pipet yukarı ve tohum yeniden askıya birkaç kez aşağı, sonra 10 ile yaklaşık 150 ul steril su pipetlemeyin - 20 tohumlar ve bahşiş altındaki tohumlar sediment kadar bekleyin. (DİKKAT: Steril şartlarda Çalışma) Not: ucu ile hafifçe agar veya örgü dokunulduğunda bir tohumuyla bir damla su (şekil 1C) için serbest bırakılır. </li> &lt;Gaz sterilizasyon durumunda li&gt; yapışkan bir yüzey sağlamak için tohumlarını almadan önce otoklava toothpicks.Pinch agar içine kürdan kullanarak tohumlarını ekmeye. Kürdan kullanarak tek tohum bir pick up ve plakaları (Şekil 1D) tohumları dağıtıyoruz. (: Steril şartlarda çalışmak DİKKAT) Alternatif olarak, tohumlara steril su ekleyin ve 1.2.1.5.1 tarif edildiği gibi ekmek. </li></ol></li><li> Hava yapışkan bir bantla kapatın ve plakalar, en az 2 gün, en fazla bir hafta boyunca karanlıkta 4 ° C de onları plakaları saklayın. Bu tabakalaşma ve senkronize sağlar ve daha verimli çimlenmesi için gereklidir. Not: Alternatif olarak, tohumlar, ekim öncesi tabakalı az soğutma alanı gerektirir mikro santrifüj tüplerine, damıtık suya daldırılır edilebilir. Bu durumda, 4 ° C&#39;de en az bir hafta süreyle tüplerini muhafaza ve hemen (1.2.1.7 bakınız), ekimden sonra büyüme odasında plakaları hareket ettirin. 3. GÜN </li&gt; <li> Büyüme odasında plakaları hareket (sürekli ışık (110 μE m -2 s-1), 21 ° C) yaklaşık dikey bir pozisyonda 5 gün boyunca (çimlenme 2 gün ve büyüme 3 gün) (80-90 °) orta kök üzerinde büyümeyi değil, emin olmak için. 8. GÜN </li></ol></li><li> Yanal Kök İndüksiyon (NAA Tedavisi) <ol><li> 1.2.1.1 ve 1.2.1.2 tarif edildiği gibi aynı büyüme ortamı hazırlayın. (: Eldiven kullanın DİKKAT) DMSO içinde NAA 50 mM stok çözeltisi hazırlayın. Aşağı 65 ° C&#39;ye kadar soğutun ve otoklavlanmış orta 10 uM NAA bir son konsantrasyon elde etmek için ortama NAA solüsyonu (DİKKAT: steril koşullar altında çalışmak). <ol><li> Yavaşça 10 saniye boyunca şişeyi çalkalayarak eklendikten sonra homojenize. Kare petri tabağı başına ortam 50 ml (12 cm x 12 cm) dökün. </li></ol></li><li> Bu sup 10 uM NPA ile desteklenmiş büyüme ortamını ihtiva eden plakalar fide aktarma10 uM NAA ile eklentilerle. <ol><li> Fide kotiledonlarında altında kavisli cımbız silah kanca ve yavaşça plaka çıkarın. Sadece kökleri tamamen tercihen aşağı NPA-büyüme ortamı ile temas büyüdü hangi fidan aktarmak. </li><li> Küçük bir mesafe boyunca NAA içeren büyüme ortamı içinde kök yağsız bir yüzey. Bitki kökleri büyüme ortamı ile iyi temas olduğundan emin olun. Gerekirse, cımbız ile büyüme ortamı yüzeyine hafifçe kök basın. Not: Büyük ölçekli deney durumunda, cımbız ile iki üst köşelerde örgü kaldırarak örgü ve transferi ile temas halinde olmayan tüm fideler çıkarın. Emin örgü küçük bir mesafe (Şekil 1E) üzerinde agar yüzeyi üzerinde örgü kaymağını tarafından NAA içeren ortamı ile iyi temas halinde olun. </li></ol></li><li> Nefes bandı ile yeni plakaları Seal ve (büyüme dolabında con koyun, devamlı ışık örnekleme kadar indüksiyonundan sonra istenen bir süre için dik bir konumda (110 μE m -2 s-1), 21 ° C). Not: büyük ölçekli deney durumunda, ağ üzerine bir defada, doğrudan kök parçalarını kesmek ve yavaşça mesh yüzeyini kazıyarak örnek onları için bir neşter kullanmak. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. lris Mısır Protokolü <ol><li> Mısır çekirdeklerde Tabakalaşma <ol><li> En az 1 hafta süreyle karanlıkta 4 ° C&#39;de mısır tanelerini inkübe edin. Not: Bu protokol B73 mısır kendilenmiş hattı kullanarak geliştirilmiştir. </li></ol></li><li> Mısır çekirdeklerde Sterilizasyon 1.GÜN Not: mısır fideleri edilen steril şartlarda yetiştirildiği olmak zorunda değildir, ancak bu, kağıt rulo mantar büyümesini önlemek için mısır tanelerini sterilize ve steril bir malzeme ile çalışılması tavsiye edilmektedirsistemi. <ol><li> Steril bir cam beher içinde, mısır tanelerinin gerekli sayıda koyun. </li><li> (Su içinde% 6 NaOCl) sterilizasyon solüsyonu (: kullan davlumbaz DİKKAT) 100 ml ekleyin. </li><li> Manyetik bir karıştırma çubuğu ilave edin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, düşük karıştırma hızında (yaklaşık 250 rpm), bir manyetik karıştırıcı Beher yerleştirin. </li><li> Taze steril su, 100 ml çözelti yerine 5 dakika boyunca beş kez çalkalayın. </li></ol></li><li> Mısır çekirdeklerde ekim <ol><li> Kontaminasyon riskini azaltmak ve kağıt havlu rulosu almak için eldiven giyin. </li><li> Iki yaprak (yaklaşık 92 cm x 24 cm) toplam uzunluğu ile el havlusu kağıt iki uzanıyor yırtın ve temiz bir yüzeye (Şekil 2A) üzerinde birbirinin üstüne koyun. </li><li> Yaprak uzunluğu (yaklaşık 92 cm x 12 cm) (Şekil 2A) üzerine çift katlayın. </li><li> T üzerinde üstten yaklaşık 2 cm 10 çekirdekleri dağıtmak için cımbız kullanınO kağıt tüm uzunluğu, her iki ucunda (Şekil 2B) serbest, her çekirdek ve 8 cm arasında, 8 cm bir ara tutulmuştur. Çekirdeğin radicle aşağı ve kağıt (Şekil 2B) doğru baktığından emin olun. </li><li> Tohum yerine (Şekil 2B) tutarken yavaşça, uzunluğu boyunca kağıt rulo. Haddeleme kolaylaştırmak için, ilk önce, steril su ile kağıt sprey isteğe bağlıdır. </li><li> Yaklaşık 6 cm çapında ve 14 cm yüksekliğinde (örneğin, 250 ml santrifüj tüpleri) ve steril cam tüplerde kağıt ruloları koyun ve bir rafa (Şekil 2C) koyun. </li></ol></li><li> Mısırda Yanal Kök İndüksiyon <ol><li> (DMSO içinde çözülmüş) bir 50 mM stok çözelti NPA (: kullanımlar eldivenler DİKKAT) hazırlayın. </li><li> Her bir tüp, bir steril cam beher 125 ml steril su 50 mM NPA stok çözeltisinden 125 ul ekleyerek 50 mcM NPA çözümünü yapmak. </li><li> İyice karıştırın vetüp kağıt rulo üzerinde 50 uM NPA çözeltisi 125 ml dökün. Kağıt rulosu çözümü emer ve tamamen batırılmış olacak. Not: Diğer boyutlarıyla kağıt rulo ve tüpler kullanırken, buna göre ses seviyesini ayarlamak. Sıvı alımını sağlamak için yeterli yarım tüp ulaşmalıdır. </li><li> Üç gün (27 ° C, sürekli ışığa,% 70 nispi nem) bir büyüme odasında kağıt rulo sistemi yerleştirin. Çözelti zaman (Şekil 2B) üzerinden buharlaşır çünkü kağıt ruloları, ekstra 50 mcM NPA çözeltisi ilave edilerek sırılsıklam kalır emin olun. 4. GÜN </li><li> (DMSO içinde çözülmüş) bir 50 mM stok çözelti NAA (: kullanımlar eldivenler DİKKAT) hazırlayın. </li><li> Her bir tüp, bir steril cam beher içinde 125 ml steril su, 50 mM NAA stoktan 125 ul eklenmesi ile 50 uM NAA solüsyon hazırlanır. </li><li> Yavaşça kağıt ruloları kalan NPA çözümün en sıkmak ve koyun5 dakika boyunca steril su m (: eldiven kullanın DİKKAT) dışarı yıkamak. Yavaşça kağıt ruloları gelen suyun çoğu sıkmak. Bu yıkama adımı üç kez tekrarlayın. </li><li> İyice karıştırın ve tüplerde kağıt ruloları üzerinde 50 mcM NAA çözüm dökün. Tamamen batırılmış emin olun. </li><li> Indüksiyon sonrası istenilen süre büyüme kabine (27 ° C, sürekli ışık,% 70 bağıl nem) kağıt rulo sistemi yerleştirin. </li></ol></li><li> Mısırın Adventif Taç Roots Yanal Kök İndüksiyon Not: İris primer kök yanal kökler indükler yukarıda tarif edildiği gibi. Ancak, mısır ve birlikte yan kökleri ile diğer monokotiledonlar, birincil kök ve embriyonik seminal kökleri içinde, fide gelişimi sırasında özellikle önemlidir. Bitki büyümesinde Daha sonraki bir aşamada, post-embriyonik adventif kökler kök üzerinde ortaya çıkan ve aynı zamanda yeni bir kök sistemine 16 oluşturmak için yan kökleri gelişir. Iris de kullanmak olabilird embriyonik birincil kök lris bazı küçük ayarlamalar takip ederek bu post-embriyonik adventif taç kökleri üzerinde yanal köklerini uyardığı. <ol><li> Kağıt rulo yapmak için, dış tarafında kağıt havlular sırasıyla iki tabaka ve içindeki çimlenme iki kağıt tabakası ile kağıt bir sandviç oluşturur. Çimlenme iki kağıt arasına sterilize çekirdekleri (adımları 2.2&#39;ye 2.1 bakınız) yerleştirin. Çimlenme kağıt, el havlusu kağıt ile karşılaştırıldığında, kağıt açılması daha sonra daha kolay rulo yapacak kök tüyleri ve yanal kökler tarafından nüfuz daha az eğilimli olacaktır. Diğer yandan, kağıt havlular, iki dış tabakayı sıvı emilimini kolaylaştırır. </li><li> 700 ml&#39;lik cam tüplerde rulo yerleştirin ve üzerlerine NPA olmadan steril su dökün. Tamamen batırılmış emin olun. </li><li> Büyüme kabine sterilize çekirdekleri çimlenmeye (adım 2.4.9 bakınız). </li><li> Adventif taç kökleri kadar fidan büyür(B73 için 6 gün) ortaya başlar. Kağıt ruloları gerektiğinde steril su ekleyerek her zaman ıslak tutulur emin olun. </li><li> Bir yıkama aşamasından sonra 50 uM NAA çözeltisi ile NPA çözeltisi değiştirerek yan kök başlatma benzer indüksiyon ardından 4 gün boyunca (adımları 2.4.4 2.4.1 bakınız) için 25 uM NPA çözeltisi transfer (adım 2.4 2.4.9 için 0,5). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Van Norman, J. M., Xuan, W., Beeckman, T., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+branch+or+not+to+branch:+the+role+of+pre-patterning+in+lateral+root+formation.">To branch or not to branch: the role of pre-patterning in lateral root formation.</a> Development. 140, 4301-4310 (2013).</li><li>Dolan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+organisation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root.">Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root.</a> Development. 119, 71-84 (1993).</li><li>Bell, J. K., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histological+study+of+lateral+root+initiation+and+development+in+Zea+mays.">A histological study of lateral root initiation and development in Zea mays.</a> Protoplasma. 70, 179-205 (1970).</li><li>Benkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local,+efflux-dependent+auxin+gradients+as+a+common+module+for+plant+organ+formation.">Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation.</a> Cell. 115, 591-602 (2003).</li><li>Beeckman, T., Burssens, S., Inz&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peri-cell-cycle+in+Arabidopsis.">The peri-cell-cycle in Arabidopsis.</a> J. Exp. Bot. 52, 403-411 (2001).</li><li>Himanen, K., Boucheron, E., Vanneste, S., de Almeida Engler, J., Inz&#233;, D., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin-mediated+cell+cycle+activation+during+early+lateral+root+initiation.">Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation.</a> Plant Cell. 14, 2339-2351 (2002).</li><li>Jansen, L., Parizot, B., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+system+for+lateral+roots+in+Arabidopsis+thaliana+and+maize.">Inducible system for lateral roots in Arabidopsis thaliana and maize.</a> Methods Mol Biol. 959, 149-158 (2013).</li><li>Casimiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+transport+promotes+Arabidopsis+lateral+root+initiation.">Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation.</a> Plant Cell. 13, 843-852 (2001).</li><li>Himanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+profiling+of+early+lateral+root+initiation.">Transcript profiling of early lateral root initiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 5146-5151 (2004).</li><li>De Smet, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-like+kinase+ACR4+restricts+formative+cell+divisions+in+the+Arabidopsis+root.">Receptor-like kinase ACR4 restricts formative cell divisions in the Arabidopsis root.</a> Science. 322, 594-597 (2008).</li><li>Vanneste, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+progression+in+the+pericycle+is+not+sufficient+for+SOLITARY+ROOT/IAA14-mediated+lateral+root+initiation+in+Arabidopsis+thaliana.">Cell cycle progression in the pericycle is not sufficient for SOLITARY ROOT/IAA14-mediated lateral root initiation in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell. 17, 3035-3050 (2005).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+root+cap+in+root+branching+revealed+by+the+non-auxin+probe+naxillin.">A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin.</a> Nat. Chem. Biol. 8, 798-805 (2012).</li><li>Jansen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomics+as+a+tool+for+the+identification+of+root+branching+genes+in+maize.">Comparative transcriptomics as a tool for the identification of root branching genes in maize.</a> Plant Biotechnol. J. 11, 1092-1102 (2013).</li><li>Parizot, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diarch+symmetry+of+the+vascular+bundle+in+Arabidopsis+root+encompasses+the+pericycle+and+is+reflected+in+distich+lateral+root+initiation.">Diarch symmetry of the vascular bundle in Arabidopsis root encompasses the pericycle and is reflected in distich lateral root initiation.</a> Plant Physiol. 146, 140-148 (2008).</li><li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio+assays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).</li><li>Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitious+roots+and+lateral+roots:+similarities+and+differences.">Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences.</a> Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).</li><li>Grunewald, W., Parizot, B., Inz&#233;, D., Gheysen, G., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+roots:+One+common+pathway+for+all+angiosperms?.">Developmental biology of roots: One common pathway for all angiosperms?.</a> Int. J. Plant Dev. Biol. 1, 212-225 (2007).</li><li>Parizot, B., Beeckman, T., Crespi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+of+root+development.">Genomics of root development.</a> Root Genomics and Soil Interactions. , 3-28 (2012).</li><li>Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+activated+cell+sorting+of+plant+protoplasts.">Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li><li>Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection,+a+tool+for+the+global+analysis+of+gene+expression+in+specific+plant+cell+types:+identification+of+genes+expressed+differentially+in+epidermal+cells+or+vascular+tissues+of+maize.">Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize.</a> Plant Cell. 15, 583-596 (2003).</li><li>Ludwig, Y., Hochholdinger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+plant+cells.">Laser microdissection of plant cells.</a> Methods Mol Biol. 1080, 249-258 (2014).</li><li>Beeckman, T., Engler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+easy+technique+for+the+clearing+of+histochemically+stained+plant+tissue.">An easy technique for the clearing of histochemically stained plant tissue.</a> Plant Mol. Biol. Rep. 12, 37-42 (1994).</li><li>Ditengou, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+induction+of+lateral+root+initiation+in+Arabidopsis+thaliana.">Mechanical induction of lateral root initiation in Arabidopsis thaliana.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18818-18823 (2008).</li><li>Lucas, M., Godin, C., Jay-Allemand, C., Laplaze, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+fluxes+in+the+root+apex+co-regulate+gravitropism+and+lateral+root+initiation.">Auxin fluxes in the root apex co-regulate gravitropism and lateral root initiation.</a> J. Exp. Bot. 59, 55-66 (2008).</li><li>Wang, S., Taketa, S., Ichii, M., Xu, L., Xia, K., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+root+formation+in+rice+(Oryza+Sativa.+L.):+differential+effects+of+indole-3-acetic+acid+and+indole-3-butyric+acid.">Lateral root formation in rice (Oryza Sativa. L.): differential effects of indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid.</a> Plant Growth Regul. 41, 41-47 (2003).</li><li>Martinez-de la Cruz, E., Garcia-Ramirez, E., Vazquez-Ramos, J. M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxins+differentially+regulate+root+system+architecture+and+cell+cycle+protein+levels+in+maize+seedlings.">Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings.</a> J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).</li><li>Beyer, E. M., Morgan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ethylene+on+uptake,+distribution,+and+metabolism+of+indoleacetic+acid-1-14C+and+-2-14C+and+naphthaleneacetic+acid-1-14C.">Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C.</a> Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).</li><li>Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+mechanisms+controlling+uptake+and+accumulation+of+2,4-dichlorophenoxy+acetic+acid,+naphthalene-1-acetic+acid,+and+indole-3-acetic+acid+in+suspension-cultured+tobacco+cells.">Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells.</a> Planta. 198, 532-541 (1996).</li><li>Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microgenomics:+genome-scale,+cell-specific+monitoring+of+multiple+gene+regulation+tiers.">Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers.</a> Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).</li><li>Perez-Torres, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+alters+lateral+root+development+in+Arabidopsis+by+modulating+auxin+sensitivity+via+a+mechanism+involving+the+TIR1+auxin+receptor.">Phosphate availability alters lateral root development in Arabidopsis by modulating auxin sensitivity via a mechanism involving the TIR1 auxin receptor.</a> Plant Cell. 20, 3258-3272 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Arabidopsis lris protokol, sadece tamamen NPA-ihtiva eden büyüme ortamı ile temas içinde büyüdü fide transferi için önemlidir. Bu yanal kök başlatma tüm kök uzunluğu boyunca bloke olmasını sağlar. Aktarım sırasında fidanları yaralama önlemek amacıyla, kavisli bir forseps kolları fide kotiledonlarında altında asılabilir. Devirden sonra fide kökleri NAA içeren agar ortamı ile yeterli temas halinde olduğundan emin olun. Bu, küçük bir mesafe boyunca agar yüzeyi üzerinde kök kaym...

Topraktan gelen ankraj ve su alımını ve besin sağlar çünkü kök sistemi, bitki büyümesi için çok önemlidir. Bir kök sistemi gelişimi genel olarak yan kök üretimi dayandığından, bunların başlangıç ​​ve oluşum yaygın olarak incelenmiştir. Yanal kökleri kurucu hücreler 1 olarak adlandırılan, perisiklden hücrelerinin belirli bir alt başlatılır. Örneğin mısır gibi monokotlarda bölgesi, bunlar floem kutup 3 bulunan, oysa Arabidopsis thaliana gibi en dikotillere, bu hücreler, protoxylem kutup 2 yer almaktadır. Kurucu hücreleri özel hücre döngüsü genlerinin sentezlenmesi, ardından artan oksin yanıt 4 ile işaretlenmiştir (örneğin, siklin B1, 1 / CYCB1; 1), bundan sonra, asimetrik anticlinal bölümleri 5 bir birinci tur geçirilir. Koordineli antiklinal ve periclinal bölünmeler bir dizi sonra, lateral kök taslaklarının nihayet a olarak ortaya çıkacak oluşturulmuşturutonomous yanal kök. Bu olaylar bol ne de senkronize ne olduğundan konumu ve yan kök başlama zamanlaması, ancak öngörülebilir değildir. Bu, bu işlem çalışma transkriptomik gibi moleküler yaklaşımların kullanımı engeller. Bu konuya ilişkin olarak, bir yanal kök İndüklenebilir Sistemi (lris), 6 geliştirilmiştir 7. Bu sistemde, fideler, ilk sonuç olarak yan kök başlangıcı bloke, oksin taşınmasını ve birikmesini engelleyen N -1-naphthylphthalamic asit (NPA) ile muamele edilir 8. Sonradan sentetik oksin 1-naftalin asetik asit (NAA) içeren ortama fide aktararak tüm perisiklden tabakası böylece kitlesel yüksek oksin seviyelerinin indükleyici yanal kök hücre başlatarak bölünmeler 6 yanıt verir. Bu nedenle, bu sistem, geç belirli bir aşaması için zenginleştirilmiş kök örnekleri kolayca toplanmasını sağlayan, hızlı, senkron ve geniş yan kökler inisiyasyonlara açarral kök gelişimi. Daha sonra, bu numune yan kök oluşumu sırasında genom çapında ekspresyon profillerini belirlemek için kullanılabilir. Iris diğer bitki türleri bu sistemi uygulamak için yan kök Arabidopsis başlatılması ve mısır 9-13, ancak ihtiyaç hakkında zaten önemli bilgiyi vermiştir fazla genomları sıralı olarak daha belirgin hale gelir ve ekonomik önemli bilgiyi aktarmak için artan bir ilgi var türler. Burada, Arabidopsis ve darı LRISs ayrıntılı protokolleri verilmiştir. Daha sonra, sistemin kullanımına ilişkin bir örnek, mısır Iris elde transkriptomik veriler, farklı bitki türleri boyunca yanal kök başlatma sırasında korunmuş bir fonksiyonu sahip fonksiyonel homologları tespit etmek için kullanılabilir olduğunu göstererek temin edilmektedir. Diğer bitki türlerinin önerildiği için Son olarak, kılavuzlar Iris optimize etmek.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;ARABIDOPSIS LRIS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis seeds</td><td></td><td></td><td>Col-0 ecotype</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Gas sterilization of seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-centrifuge tubes 1.5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean</td></tr><tr><td>micro-centrifuge tubes 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>hydrochloric acid</td><td>Merck KGaA</td><td>1,003,171,000</td><td>37% (fuming) for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu</td></tr><tr><td>glass desiccator</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Pyrex</td></tr><tr><td>glass beaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastic micro-centrifuge tubes box or holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bleach sterilization of seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Ethanol, abs. 100% a.r. dilute to 70%</td></tr><tr><td>sodium hypochlorite (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog salt mixture</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>VWR, Internation LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-Sucrose Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>1050211000</td><td>pellets for analysis (max. 0.002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Plant Tissue Culture Agar</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lateral root induction chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>10 &amp;micro;M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>1-naphthalene acetic acid (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>10 &amp;micro;M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Making a mesh for transfer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nylon mesh</td><td>Prosep byba</td><td></td><td>Synthetic nylon mesh 20 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sowing and seedling handling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>square petri dish plates</td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml DURAN tubes</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&amp;nbsp;50 ml centrifuge tubes</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cut pipette tips</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>Universal 200, cut off 5 mm of tip before autoclaving</td></tr><tr><td>breathable tape&amp;nbsp;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>cat. no. 1530-1</td><td></td></tr><tr><td>tweezers</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth conditions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growth room</td><td></td><td></td><td>21 &amp;deg;C, continuous light</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;MAIZE LRIS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Seeds&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maize kernels</td><td></td><td></td><td>B-73</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bleach sterilization of kernels&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass beaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnetic stirrer&amp;nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>sodium hypochlorite (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lateral root induction chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-naphthylphthalamic acid (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0926.0250</td><td>50 &amp;micro;M (maize primary root), 25 &amp;micro;M (maize adventitious root)</td></tr><tr><td>1-naphthalene acetic acid (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>No. N0903.0050</td><td>50 &amp;micro;M (maize)</td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sowing and seedling handling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>paper hand towels</td><td>Kimberly-Clark Professional*</td><td>6681</td><td>SCOTT Hand Towels - Roll / White; sheet size (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>seed germination paper</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38# seed germination paper</td></tr><tr><td>tweezers</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7</td></tr><tr><td>250 ml (centrifuge) tubes</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>approx. 5.6 cm diameter and 14.7 cm height&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>700 ml tubes</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>cylinders, round foot tube, D 60&amp;nbsp; x 250</td></tr><tr><td>rack</td><td></td><td></td><td>for maize tubes, home made</td></tr><tr><td>sterile water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Growth conditions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>growth cabinet</td><td></td><td></td><td>27 &amp;deg;C, continuous light, 70% relative humidity</td></tr></tbody></table>

lateral root inducible system in arabidopsis and maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Iris Uygulama Yanal Kök Başlatma Süreci Karşılaştırmalı transkriptomik gerçekleştir İris bir uygulaması, farklı türlerde yan kök oluşumu esnasında karşılaştırma ve gen ekspresyon profillerinin korelasyondur. Karşılaştırmalı transkriptomik farklı türler lateral kök geliştirme sürecine dahil orthologous genleri saptamak için olanak yaratmak yaklaşır. Önceden oluşturulmuş kök...

Watch this Scientific Journal Video about Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize at JoVE.com

Arabidopsis ve Mısırda Yanal Kök İndüklenebilir Sistem | Biyoloji | Video

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral Kök İndüklenebilir Sistemi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Ve Mısır

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

lateral-root-inducible-system-in-arabidopsis-and-maize

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Plant Biology

Plant Structure, Growth, and Nutrition

SCIENTISTS IN ACTION

13.7K Görüntüleme.  Ghent. The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Video: Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not detected or are not identified as differentially expressed (DE) in transcriptomic analyses of whole plant organs. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is a powerful tool to identify genes that are DE in specific developmental domains. However, the choice of cellular domains to microdissect and compare, and the accuracy of the microdissections are crucial to the success of the experiments. Here, two examples illustrate design considerations for transcriptomics experiments; a LM RNA-seq analysis to identify genes that are DE along the maize leaf proximal-distal axis, and a second experiment to identify genes that are DE in liguleless1-R (lg1-R) mutants compared to wild-type. Key elements that contributed to the success of these experiments were detailed histological and in situ hybridization analyses of the region to be analyzed, selection of leaf primordia at equivalent developmental stages, the use of morphological landmarks to select regions for microdissection, and microdissection of precisely measured domains. This paper provides a detailed protocol for the analysis of developmental domains by LM RNA-Seq. The data presented here illustrate how the region selected for microdissection will affect the results obtained.

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Biyokimya

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

Genetik

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is needed to open up the structure of the plant cell wall, increasing the accessibility of the cell wall carbohydrates. Lignin, a polyphenolic material present in many cell wall types, is known to be a significant hindrance to enzyme access. Reduction in lignin content to a level that does not interfere with the structural integrity and defense system of the plant might be a valuable step to reduce the costs of bioethanol production. In this study, we have genetically down-regulated one of the lignin biosynthesis-related genes, cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1) via a double stranded RNA interference technique. The ZmCCR1_RNAi construct was integrated into the maize genome using the particle bombardment method. Transgenic maize plants grew normally as compared to the wild-type control plants without interfering with biomass growth or defense mechanisms, with the exception of displaying of brown-coloration in transgenic plants leaf mid-ribs, husks, and stems. The microscopic analyses, in conjunction with the histological assay, revealed that the leaf sclerenchyma fibers were thinned but the structure and size of other major vascular system components was not altered. The lignin content in the transgenic maize was reduced by 7-8.7%, the crystalline cellulose content was increased in response to lignin reduction, and hemicelluloses remained unchanged. The analyses may indicate that carbon flow might have been shifted from lignin biosynthesis to cellulose biosynthesis. This article delineates the procedures used to down-regulate the lignin content in maize via RNAi technology, and the cell wall compositional analyses used to verify the effect of the modifications on the cell wall structure.

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

A double stranded RNA interference (dsRNAi) technique is employed to down-regulate the maize cinnamoyl coenzyme A reductase (ZmCCR1) gene to lower plant lignin content. Lignin down-regulation from the cell wall is visualized by microscopic analyses and quantified by the Klason method. Compositional changes in hemicellulose and crystalline cellulose are analyzed.

Lignin Aşağı düzenleme<em&gt; Zea mays</em&gt; DsRNAi ve Klason Lignin Analizi ile

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Biyomühendislik

Inoculation Strategies to Infect Plant Roots with Soil-Borne Microorganisms

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide variety of microorganisms, but studies on soil-borne interactions are still behind those performed on aboveground organs. Although some inoculation strategies for infecting model plants with model root pathogens are described in the literature, it remains difficult to get a comprehensive methodological overview. To address this problem, three different root inoculation systems are precisely described that can be applied to gain insights into the biology of root-microbe interactions. For illustration, Verticillium species (namely, V. longisporum and V. dahliae) were employed as root invading model pathogens. However, the methods can be easily adapted to other root colonizing microbes - both pathogenic and beneficial. By colonizing the plant xylem, vascular soil-borne fungi such as Verticillium spp. exhibit a unique lifestyle. After root invasion, they spread via the xylem vessels acropetally, reach the shoot, and elicit disease symptoms. Three representative plant species were chosen as model hosts: Arabidopsis thaliana, economically important oilseed rape (Brassica napus), and tomato (Solanum lycopersicum). Step-by-step protocols are given. Representative results of pathogenicity assays, transcriptional analyses of marker genes, and independent confirmations by reporter constructs are shown. Furthermore, the advantages and disadvantages of each inoculation system are thoroughly discussed. These proven protocols can assist in providing approaches for research questions on root-microbe interactions. Knowing how plants cope with microbes in the soil is crucial for developing new strategies to improve agriculture.

This protocol presents a detailed summary of strategies to inoculate plant roots with soil-borne microbes. Exemplified for the fungi Verticillium longisporum and Verticillium dahliae, three different root infection systems are described. Potential applications and possible downstream analyses are highlighted, and advantages or disadvantages are discussed for each system.

Bitki Köklerini Toprak Kaynaklı Mikroorganizmalarla Enfekte Etmek için Aşılama Stratejileri

The rhizosphere harbors a highly complex microbial community in which plant roots are constantly challenged. Roots are in close contact with a wide ...

Çevre

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Gelişim Biyolojisi

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Biyoloji

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Bir Gel Yüzeyinde Büyüyen Bitki kökleri Işık Sac Flüoresan Mikroskopi

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) and Wuschel2 (Wus2). Bbm is regulated by the maize phospholipid transferase gene (Pltp) promoter, and Wus2 is under the control of a maize auxin-inducible (Axig1) promoter. An Agrobacterium strain carrying these morphogenic genes on transfer DNA (T-DNA) and extra copies of Agrobacterium virulence (vir) genes are used to infect maize immature embryo explants. Somatic embryos form on the scutella of infected embryos and can be selected by herbicide resistance and germinated into plants. A heat-activated cre/loxP recombination system built into the DNA construct allows for removal of morphogenic genes from the maize genome during an early stage of the transformation process. Transformation frequencies of approximately 14%, 4%, and 4% (numbers of independent transgenic events per 100 infected embryos) can be achieved for W22, B73, and Mo17, respectively, using this protocol.

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Plant morphogenic genes can be used to improve genetic transformation of recalcitrant genotypes. Described here is an Agrobacterium-mediated genetic transformation (QuickCorn) protocol for three important public maize inbred lines.

Agrobacterium-Rekalsitrant Mısır Inbred Hatları Morfojenik Genler Kullanarak Aracılı Olgunlaşmamış Embriyo Dönüşümü

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

Bitkilerde Agrobakteri Aracılı Tüylü Kök İndüksiyonu ve Rejenerasyonu

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

Yazar Spotlight: Brassicaceae'de Gelişmiş Verimlilik için Tüylü Kök Bazlı Dönüşüm Protokollerinin Optimize Edilmesi

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Lateral Kök İndüklenebilir Sistemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler