Bu yöntem, proteinlerin proteolitik modifikasyonu gibi biyokimya alanındaki anahtar soruların yanı sıra inhibitörlerin, proteazların ve peptidazların karakterizasyonuna yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, verilen proteinin dekolte tarafını temsil eden, peptidler üzerinde proteolitik aktivitenin hızlı bir şekilde taranmasına olanak sağlamasıdır. Burada kullanımı viral füzyon aktive proteazlar çalışmaktır.
Peptit tasarımında ilk adım, ncbi veya virüs patojen veritabanı gibi bir kamu veritabanından ilgi füzyon protein in dizisini elde etmektir. Füzyon peptid devam proteaz tanıma sitesi seçin ve bu dizinin yukarı ve aşağı iki ila üç amino asitler içerir. Peptit sipariş ederken, floresan rezonans enerji transferi veya FRET çifti, Son terminus mca ve c terminus dnp ile değiştirin.
Teşbe sırasında Mca heyecanlıdır ve dnp tarafından söndürülen ışık enerjisi yayır. Ancak, bölünme oluşursa, Dnp daha sonra floresan plaka okuyucu tarafından okunabilir emisyon söndürmek mümkün olmayacaktır. Üreticileri tavsiyelerine göre peptidi yavaşça yukarı ve aşağı boruile tutarak yeniden askıya alın.
Örneğin, bir milimolar son konsantrasyonu için% 70 etanol resuspend. Peptit pipetleme ile çok iyi bir şekilde askıya almazsa, peptit ve çözücü içeren tüpü tamamen askıya alınana kadar bir sonication banyosuna yerleştirin. Peptidin beyazlatmadan korunması için 100 mikrolitrelik peptidi ışık sönümleme veya dirençli tüplere dağıtın.
Aliquots eksi 20 santigrat derece saklayın. Plaka okuyucuyu açarak ve kendi testi bitene kadar bekleyerek bu yordamı başlatın. Ardından, bağlı bilgisayardaki işletim yazılımını açın ve plaka okuyucuya bağlı olduğundan emin olun.
Bu durumda sıcaklık ayarını açın ve proteaz için en iyi performans için gerekli sıcaklığa ayarlayın, ki bu durumda 30 santigrat derecedir. Denemeyi ayarlamak için, kontrol aleti kurulumuna tıklayın, kinetik seçin ve ardından floresan'ı seçin. 330 nanometre uyarma dalga boyu ve 390 nanometre emisyon dalga boyu girin.
Otomatik kesmeyi seçin ve orta/normal hassasiyeti seçin. Tayni için bir saatlik bir çalışma süresi seçin ve her 60 saniyede bir ölçüm seçin. İlk ölçümden önce beş saniye, her ölçümden önce üç saniye karıştırma ayarlayın.
Son olarak, okumak için kuyuseçin. Metin protokolünde açıklandığı gibi proteses için uygun test tamponları hazırlayın ve buz üzerinde tamponlar soğutun. Soğutma ve stabiliteyi desteklemek için altında ince bir metal plaka içeren, katı siyah polistiren işlenmemiş düz alt 96 kuyulu bir plakayı buz üzerine yerleştirin.
Bitişik kuyulardan floresan sızıntısını önlemek için, yüzer plaka olarak siyah bir plaka kullanmak esastır. Peptit başına, tsay başına üç teknik çoğaltma ve numune başına 100 mikrolitre toplam hacmi hazırlamak. Pipet, her bir sayak plakasının her kuyuya uygun miktarda ki sataş arabelleği.
Her kuyuya 0,5 mikrolitre proteaz ekleyin. Altı kuyuya, ilgili proteaz yerine 0,5 mikrolitre tampon ekleyin. Bunlardan üçü kör kontrol, diğer üçü de peptid kontrolleri olacak.
Kör kontroller hariç, her kuyuya 50 mikromolar son konsantrasyonuna peptid beş mikrolitre ekleyin. Üç kör kontrol kuyularının her birine, peptit yerine beş mikrolitre tampon ekleyin. Tablayı flourescents plaka okuyucusuna takın ve başlat'ı tıklatın.
Veri çözümlemesi başlamadan önce deneme dosyasını kaydedin. Dışa aktarma'ya tıklayın ve dosyayı txt olarak dışa aktarın. TXT dosyasını elektronik tabloya aktarın.
Bir grafik oluşturarak, y ekseninde göreli floresan birimlerini, numune başına her bir teknik çoğaltma için x eksenindeki zamana göre çizerek başlatın. Grafiğin doğrusal aralıkta olduğu ve floresan artışın başlangıcına en yakın olan veri aralığını seçin. Seçili verileri ikinci bir grafikte çizin ve doğrusal bir eğilim çizgisi ekleyin.
Eğilim çizgisi seçeneklerinde, grafikte görüntü denklemini seçin. Denklem, eğilim çizgisinin eğimine karşılık gelen V max'i gösterir. Üç teknik çoğaltmadan her örnek için ortalama V max'i hesaplayın.
Deneyi iki kez daha tekrarladıktan sonra, üç biyolojik kopya elde etmek için, üç bağımsız biyolojik kopyadan elde edilen verilere dayanarak standart sapmayı hesaplayın. İnsan MERS coronavirus, EMC/2012 S2 prime site ve deve türetilmiş çift mutant suşu HKU205'in furin dekolte suşları, EMC/2012'nin tek mutant varyantları ile birlikte EMC/2012 peptidin verimli bir şekilde yarık olduğunu, HKU205'in S2 asal dekoltünün neredeyse hiç bölünmediğini ortaya koymuştur. EMC/2012 A-S mutasyona uğramış S2 prime peptidde bölünme kuvvetle azaltıldı ve EMC/2012 S'nin neredeyse hiç dekoltesi yoktu.
Başka bir furin dekolte testi deve türetilmiş Fas sadece minimal dekolte gösterdi 213 S2 prime site, insan MERS coronavirus ile karşılaştırıldığında, EMC/2012 S2 prime site. Furin dekoltesi prototipik S1/S2 peptid, FECV I ve 4 S1/S2 için gözlendi, ancak mutasyona uğramış S1/S2 peptid, FIPV I Black S1/S2'de gözlendi. Benzer şekilde, furin prototipsatipik S2 prime peptid, FECV II 1683 S2 prime, ancak mutasyona uğramış S2 prime peptidler, FECV I ve 4 S2 prime, FIPV I Black S2 prime ve FIPV II 1146 S2 prime'ı ayırabildi.
Bu prosedürü takiben, batı leke analizi veya amino-floresan tahlilleri, ilgi tam uzunlukta protein kullanarak protein bölünmesi doğrulamak için yapılabilir, ya da bu durumda, eğer dekolte viral füzyon proteinin in fusojenik versiyonu ile sonuçlanır.
