Bu protokol, araştırmacıların kaspaz aktivitesinin hücre ölümü ile birlikte gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemelerini ve böylece farklı hücre ölümü modlarını tanımlamalarını sağlar. Bu tekniğin avantajı, popülasyon bazlı bir tahlilde veya tek hücrede kaspaz aktivitesini değerlendirme esnekliğidir. Prosedürü gösteren, doktora mezunu Stefanie Rufli ve Wendy Wei-Lynn Wong'un laboratuvarından misafir doktora öğrencisi Jing Tong olacak.
Kemik iliği kaynaklı makrofajları veya BMDM'leri el yazmasında açıklandığı gibi ayırt ettikten ve topladıktan sonra, mililitre başına altıncı hücrelere bir kez 10 kat yoğunlukta altı kuyucuklu bir plakaya tohumlayın. Hücreleri 16 saat boyunca SMAC mimetik ile tedavi edin. Hücre lizatını hazırlamak için, işlenmiş hücreleri içeren plakayı buzun üzerine aktarın ve hücre kültürü ortamını 1.5 mililitrelik bir tüpe toplayın.
Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj. Ortamı aspire edin ve tüpü buzun üzerine koyun. Daha sonra hücreleri yıkamak için hücre kültürü plakasına bir mililitre soğuk PBS ekleyin.
Tüm PBS'yi aspire ettikten sonra, hücrelere 100 mikrolitre tripsin ekleyin. Hücreler plakadan ayrıldıktan sonra, bunları 1.5 mililitrelik tüpe toplayın. Hücre süspansiyonunu santrifüjledikten sonra, süpernatantı çıkarın ve peleti 100 mikrolitre DISC lizis tamponunda yeniden askıya alın.
Numuneyi 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve daha sonra çözünmeyen fraksiyonu peletlemek için lizatı santrifüj edin. Kaspaz-3/7 aktivite testi için 25 mikrolitre lizatı beyaz düz tabanlı 96 delikli bir plakaya ve bikinkoninik asit veya BCA testi için şeffaf düz tabanlı 96 delikli bir plakaya 10 mikrolitre aktarın. Protein miktarı için, standart bir protein olarak bir dizi sığır serum albümini veya BSA konsantrasyonu hazırlayın.
Numuneleri içeren düz tabanlı 96 delikli plakaya standart BSA eklendikten sonra, BCA reaktiflerini bir ve ikisini 50'ye bir oranında karıştırın ve standart olarak her numuneye 200 mikrolitre ekleyin. 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, florometrik bir cihazda 562 nanometrede absorbansı ölçün ve protein konsantrasyonunu standart eğri ile ölçün. Popülasyon bazlı bir tahlil yapmak için, florometrik cihazı başlatın ve makineyi 30 santigrat dereceye ısıtın.
Uyarma ve emisyon dalga boyunu sırasıyla 360 ve 465 nanometreye ayarlayın. Daha sonra kaspaz aktivitesini belirlemek için el yazmasında açıklandığı gibi buz üzerinde bir ana reaksiyon karışımı hazırlayın. Her numuneye 75 mikrolitre karışım ekleyin ve toplam 100 mikrolitrelik bir reaksiyon hacmi elde etmek için standarttır.
Florometrik cihaz kurulumunu kullanarak floresanı hemen ölçün ve reaksiyon kinetiğini belirlemek için 40 dakika boyunca her dakika bireysel okumaları kaydedin. Tohumlamadan sonra, yapışkan hücreleri daha önce gösterildiği gibi beş mililitrelik bir polistiren tüpe toplayın. Daha sonra numuneyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.
Boyama karışımını hazırlamak için, florojenik substratın bir mikrolitresini alın ve 150 mikrolitre PBS ile seyreltin. Numune başına 50 mikrolitre boyama karışımı ekleyin, karanlıkta 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve her 15 dakikada bir karıştırın. Bu popülasyon bazlı tahlilde, kaspaz-3/7 aktivitesi için kinetik tahlilin temsili verileri, SMAC mimetik konsantrasyonunun artmasıyla substrat bölünmesinin arttığını göstermiştir.
Bununla birlikte, 500 nanomolar konsantrasyondaki artış, çoklu karşılaştırmalara sahip sıradan bir tek yönlü ANOVA'ya dayanarak önemsizdi. Akış sitometrisi kullanılarak kaspaz-3/7 aktivitesinin analizi, SMAC mimetiği ile tedavi edilen hücreler için floresanda, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla floresanda bir kayma olduğunu göstermiştir; bu, çizilmiş medyan floresan yoğunluğunda da belirgindi ve 500 nanomolar konsantrasyondaki artış anlamlıydı. İşlem buz üzerinde yapılmalıdır.
Bununla birlikte, popülasyon bazlı tahlilde, örnekler süresiz olarak buz üzerinde bırakılamaz. Lizis adımından sonra, numuneler derhal daha fazla işlenmeli veya dondurulmalıdır. Canlı hücre mikroskobu kullanarak kaspaz aktivitesinin görüntülenmesi, tek bir hücre düzeyinde kinetik bilgi elde etmek için ek bir yöntem olacaktır.
