Hücresiz protein ekspresyonu için protokolümüz, basit ve zaman tasarruflu iki aşamalı sonication-santrifüj işlemi kullanılarak hazırlanan hızlı büyüyen vibrio natriegens bakterisinden son derece aktif ham ekstresi kullanır. Ham hücre ekstresi hazırlama ve hücre içermeyen protein sentezi tek bir kullanıcı tarafından bir ila iki gün içinde elde edilerek bu tekniğin biyoprodüksiyon veya sentetik biyoloji uygulamaları için boru hatlarına kolayca entegre edilmesi sağlanabilir. Bir gecede Vibrio natriegens kültürünün bir mililitre yıkama başlamak için bir dakika için 10, 600 kez g bir tezgah üstü santrifüj onu santrifüj tarafından.
Pelet rahatsız etmeden supernatant aspire, ve taze LB-V2 medya bir mililitre resuspend. Bir mililitre yıkanmış gece kültürünü bir litre taze LB-V2 büyüme ortamına otoklavlı dört litrelik bir otoklavlı Erlenmeyer şişesinde aşılayarak steril kapaklı bire bir seyreltme istihkakı elde edin. 225 RPM sallayarak 30 santigrat derece kültür büyümek.
OD 600 kültürlerini izlemek için bir spektrofotometre kullanın. Ve 1.0 artı veya eksi 0.2'ye ulaştığında kültürü, 500 mililitrelik iki tüphalinde 3, 500 kez g'de santrifüj ederek 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca hasat edin ve sonra buza yerleştirin. Supernatant aspire ve pelet hemen işlem.
Hücre lisis prosedürüne başlamadan önce serin taze hazırlanmış S30 lysis tampon pH 7.7 yaklaşık dört santigrat derece, Aynı litre kültürden kaynaklanan tüm peletleri yeniden askıya almak için bu soğuk S30 lysis tampon10 mililitre kullanın. Ve süspansiyonu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bu süspansiyonu 3, 500 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin ve sonra peleti bozmadan süpernatantı aspire edin ve buza yerleştirin.
Soğuk bir odada çalışmak, buz üzerine yerleştirilen 50 mililitrelik tüpteki pelete 500 mikrolitre soğuk S30 lysis tamponu ekleyin. Peleti yeniden askıya almak için geniş bir pipet ucu kullanın ve dikkatlice buz üzerinde de iki mililitrelik bir tüpe aktarın. Çok aktif ham özler üretmek için biz hücrelerin Üzerinde S30 tampon ile seyreltilmiş olmadığından emin olmak gerekir, ama verimli sonication için yeterli sıvı var.
600 mililitrelik bir kabı buzla doldurun ve buzun üzerine iki mililitrelik bir tüp tutucu yerleştirin. Hücreleri homojenize etmek için tüpü kısa bir süre girdaplayın. Kapağın altındaki hücreleri çıkarmak için hareket ettirin ve kapağı açık tüp tutucuya yerleştirin.
Tüpteki hücre süspansiyonuna alt sonicator ucu, böylece sıvı yüzeyin hemen altındadır. Sonication kurulum bir sonicator ve 1/8-inç uç çapı ile sonda kullanarak hazırlayın. Sonicator'u 20 kilohertz frekansında ve %50 genlikte ayarlayın.
10 saniyelik nabız süresi ve 60 saniyelik nabız-kapama süresi. Üç döngü için darbe sonication protokolünü çalıştırın. Ve sonra 16,000 kez g'de 4 santigrat derecede 4 derecede santrifüj ham hücre ekstresi.
Sonication gerçekleşir gibi görsel olarak hücre lysis incelenmesi sonication beklendiği gibi çalıştı sağlamak için önemlidir. Soğuk bir odada çalışan aliquot 50 mikrolitre yeni iki mililitrelik tüpler için ortaya çıkan supernatants pelet rahatsız değil emin olun. Flaş dondurma kAlıntılar bu ham hücre özleri bağlı bir daldırma dize ile bir tüp tutucu içine tüpler yerleştirin ve sıvı azot içeren bir dewar içine batırın ve dondurulmuş olup olmadığını kontrol edin.
DNA şablonu 10X enerji çözeltisi ana karışımı, 4X amino asit ana karışımı aliquots ve oda sıcaklığında DNA şablonu kullanarak hücresiz protein ifadesi gerçekleştirmek için. Daha sonra T7 RNA polimeraz ve RNae inhibitör stoklarını eksi 20 santigrat derecelik dondurucudan çıkarın ve buza yerleştirin. DNA şablonu, 10X enerji çözeltisi ana karışımı ve 4X amino asit ana karışımı çözülür, buz üzerinde yer.
Buz üzerinde iki mililitrelik bir tüp için doğru sırada her bileşeni ekleyerek bir hücre içermeyen reaksiyon ana karışımı hazırlayın ve yavaşça ana karışımı her ek sonra tüp flick. Vibrio natriegens ham hücre lisate eksi 80 derece santigrat dondurucu ve çözülene kadar 10 ila 20 dakika buz üzerinde yerleştirin çıkarın. Çözülmüş ham hücre ekstresinin uygun hacmini hücre içermeyen reaksiyon ana karışımına ekleyin ve pipet kullanarak hafifçe karıştırın.
Termocycler kullanarak uç nokta hücresiz protein ekspresyonu gerçekleştirmek için, ilk olarak 96 kuyulu BIR PCR plakanın alt kısmındaki hücresiz reaksiyon ana karışımının 10 mikrolitresini ekleyin ve tüpü PCR plakasına her transfer arasında hafifçe hareket ettirerek ana karışımı karıştırın. 1, 000 kez g 10 saniye boyunca kuyu kenarlarına sıkışmış olabilir herhangi bir ana karışımı havuz için plaka santrifüj. Ve sonra buharlaşmayı önlemek için bir tabak yapıştırıcı ile kuyumühür.
Plakayı, 105 santigrat derece ısıtılmış bir kapak seti ile 26 santigrat derecede bir termocycler setine yerleştirin. PCR plakasındaki reaksiyonları en az üç saat kuluçkaya yatırdıktan sonra, ifade edilen proteinler saflaştırılabilir, ölçülebilir ve akış aşağı prosesleri için kullanılabilir. Bir plaka okuyucu pipet içip kullanarak hücre içermeyen protein ekspresyonu kinetik izlemek için 10 mikrolitre hücre içermeyen reaksiyon ana karışımı net cam dipleri ile siyah 384-iyi andsay plaka altına.
Ve buharlaşmayı önlemek için açık bir plaka yapıştırıcı ile kuyumühür. İfade edilen proteine karşılık gelen uygun floresan uyarma/emisyon dalga boylarını izlerken, yüz sayma plakasını 26 santigrat derece ye ayarlanmış bir plaka okuyucusuna yerleştirin ve üç ila altı saat kuluçkaya yatırın. Bu protokolde tanımlanan hücresiz ifade sistemi, plazmid DNA şablonu ile en iyi sonuçları elde ederek, uç nokta ve kinetik tahlillerle gösterilen aynı miktardan daha yüksek miktarda protein verir.
in-vitro transkripsiyon reaksiyonları tarafından oluşturulan mRNA da kullanılabilir, ancak daha yüksek miktarda mRNA gereklidir. Protein üretiminin verimi magnezyum ve potasyum iyonlarının konsantrasyonundan önemli ölçüde etkilenmiştir. Optimize edilmiş koşullar altında optimal magnezyum iyon konsantrasyonu bulundu 3.5 milimolar ve potasyum iyon için, 80 milimolar.
Bu nedenle, bu optimal iyon konsantrasyonlarından sapmalar, bu ifade sisteminin önemli protein verimleri üretme kapasitesinin azalmasına neden olabilir. Tüm reaktifleri buzda tutmak veya mümkün olduğunca soğuk bir odada çalışmak önemlidir. Ayrıca, uygun ve tam sonication bu protokolün başarısı için önemlidir.
Bu protokolü takiben kullanıcılar proteinleri yüksek iş itfa formatında ifade etme kapasitesine sahip olacaklar, bu da birçok farklı proteinin aktivitesini arındırmak ve taramak için kullanılabilir. Bu teknik, hücresiz ifade için benzersiz özelliklere sahip yeni organizmaların kullanımını göstermektedir. Vibrio natriegens daha önce kurulmuş model organizmalarda keşfedilmemiş proteinler veya küçük moleküllerin ekspresyonu için benzersiz koşullar sunabilir bir halofilik hızlı büyüyen bakteridir.
