Nosso protocolo de expressão proteica livre de células utiliza extrato bruto altamente ativo da bactéria vibrio natriegens de rápido crescimento, que é preparada usando um processo simples e eficiente de sonicação de duas etapas. A preparação do extrato de células brutas e a síntese de proteínas livres de células podem ser alcançadas em um ou dois dias por um único usuário, permitindo que essa técnica seja facilmente integrada em dutos para aplicações de bioprodução ou biologia sintética. Para começar a lavar um mililitro da cultura de natriegens vibrio durante a noite, centrifugando-o em uma centrífuga de bancada a 10,600 vezes g por um minuto.
Aspire o supernatante sem perturbar a pelota, e resuspend em um mililitro de mídia LB-V2 fresca. Inoculado um mililitro de cultura lavada durante a noite em um litro de mídia fresca de crescimento LB-V2 em um frasco erlenmeyer autoclavado de quatro litros perplexo com cobertura estéril para alcançar uma a mil ração de diluição. Cresça cultura a 30 graus Celsius enquanto treme para 225 RPM.
Use um espectrômetro para monitorar as culturas OD 600. E quando atingir 1,0 mais ou menos 0,2 colher a cultura centrifugando-a em dois tubos de 500 mililitros a 3.500 vezes g por 20 minutos a quatro graus Celsius, e depois colocá-la no gelo. Aspire o supernasce e processe a pelota imediatamente.
Antes de iniciar o procedimento de lise celular esfriar o pH tampão S30 recém-preparado de 7,7 a aproximadamente quatro graus Celsius, use 10 mililitros deste tampão de lise S30 frio para suspender de novo todas as pelotas resultantes da mesma cultura de um litro. E transferir suspensão para um tubo de 50 mililitros. Centrifugar esta suspensão a 3.500 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius, e depois aspirar o supernaente sem perturbar a pelota e colocá-la no gelo.
Trabalhar em uma sala fria adicione 500 microliters de tampão de lise S30 frio à pelota no tubo de 50 mililitros colocado no gelo. Use uma ponta de pipeta larga para resuspensar a pelota e transferi-la cuidadosamente para um tubo de dois mililitros também no gelo. Para produzir extratos brutos muito ativos, devemos garantir que as células não estejam mais diluídas com tampão S30, mas tenham líquido suficiente para sônica eficiente.
Encha um copo de 600 mililitros com gelo e coloque um suporte de tubo de dois mililitros em cima do gelo. Vórtice o tubo brevemente para homogeneizar as células. Filme para remover todas as células na parte inferior da tampa e coloque no suporte do tubo com a tampa aberta.
A ponta do sonicador inferior na suspensão celular no tubo de modo que ele esteja logo abaixo da superfície líquida. Prepare a configuração da sônica usando um sonicator e uma sonda com um diâmetro de ponta de 1/8 polegadas. Coloque o sonicator em 20 kilohertz e 50% de amplitude.
Tempo de pulso de 10 segundos, e tempo de pulso de 60 segundos. Execute o protocolo de sônica de pulso por três ciclos. E então centrífuga extrato de célula bruta a 16.000 vezes g por 30 a 45 minutos a quatro graus Celsius até que o lysate esteja livre de qualquer detrito celular.
Inspecionar visualmente a lise celular à medida que a sônica ocorre é fundamental para garantir que a sônica tenha funcionado como esperado. Trabalhando em uma aliquot 50 microliters de sala fria dos supernantes resultantes para novos tubos de dois mililitros certificando-se de não perturbar a pelota. Para congelar esses extratos de células brutas coloque os tubos em um suporte de tubo com uma corda de mergulho presa e submersa em uma de guerra contendo nitrogênio líquido e verifique se está congelado.
Para realizar a expressão proteica livre de células usando o modelo de DNA descongelar 10X solução de energia master mix, 4X aminoácidos mestre mistura alíquotas e modelo de DNA à temperatura ambiente. Em seguida, remova os estoques inibidores de polimerase T7 RNA e RNAse do congelador menos 20 graus Celsius e coloque no gelo. Uma vez que o modelo de DNA, 10X energy solution master mix, e 4X aminoácidos master mix são descongelados, coloque no gelo.
Prepare uma mistura mestre de reação livre de células adicionando cada componente na ordem precisa a um tubo de dois mililitros no gelo, e gire suavemente o tubo após cada adição à mistura mestre. Remova o liseto de células brutas vibrio natriegens do congelador de menos 80 graus Celsius e coloque no gelo por 10 a 20 minutos até descongelar. Adicione o volume apropriado de extrato de célula bruta descongelado à mistura mestre de reação livre de células e misture suavemente usando uma pipeta.
Para realizar a expressão proteica livre de células endpoint usando termociclador, adicione primeiro 10 microliters da mistura mestre de reação livre de células por poço da parte inferior de uma placa PCR de 96 poços certificando-se de misturar a mistura mestre, movendo o tubo suavemente entre cada transferência para a placa PCR. Centrifugar a placa a 1.000 vezes g durante 10 segundos para agrupar qualquer mistura mestre que possa ter sido presa nas laterais dos poços. E, em seguida, selar os poços com um adesivo de placa para evitar a evaporação.
Coloque a placa em um conjunto termociclador a 26 graus Celsius com uma tampa aquecida a 105 graus Celsius. Após a incubação das reações na placa PCR por um mínimo de três horas, as proteínas expressas podem ser purificadas, quantificadas e usadas para processos a jusante. Para monitorar cinética de expressão proteica livre de células usando uma pipeta leitora de placas 10 microliters por poço da mistura mestre de reação livre de células ao fundo de uma placa de ensaio preto 384-bem com fundo de vidro claro.
E sele os poços com um adesivo de placa clara para evitar a evaporação. Coloque a placa de ensaio em um conjunto de leitor de placas a 26 graus Celsius e incubar por três a seis horas enquanto monitora os comprimentos de onda fluorescentes/emissões apropriados correspondentes à proteína expressa. O sistema de expressão livre de células descrito neste protocolo alcança os melhores resultados com modelo de DNA plasmídeo produzindo uma quantidade significativamente maior de proteína do que a mesma quantidade de DNA linear mostrada pelos ensaios finais e cinéticos.
mRNA gerado por reações de transcrição in vitro também poderia ser usado, mas quantidades maiores de mRNA são necessárias. O rendimento da produção de proteínas foi significativamente afetado pela concentração de íons de magnésio e potássio. Em condições otimizadas, a concentração ideal de íons de magnésio foi encontrada em 3,5 milialares e para íon de potássio, 80 mililitros.
Assim, desvios dessas concentrações de íons ideais podem resultar em uma diminuição da capacidade deste sistema de expressão de produzir rendimentos significativos de proteínas. É importante manter todos os reagentes no gelo ou trabalhar em uma sala fria o máximo possível. Além disso, a sônica adequada e completa é fundamental para o sucesso deste protocolo.
Seguindo este protocolo, os usuários terão a capacidade de expressar proteínas em um formato de alto rendimento, que pode ser usado para purificar e tela para atividade de muitas proteínas diferentes. Esta técnica demonstra o uso de novos organismos com propriedades únicas para a livre expressão celular. Vibrio natriegens é uma bactéria halofílica de rápido crescimento que pode oferecer condições únicas para a expressão de proteínas ou pequenas moléculas previamente inexploradas em organismos modelos estabelecidos.
