Nuestro protocolo para la expresión de proteínas libres de células utiliza extracto crudo altamente activo de la bacteria de rápido crecimiento Vibrio natriegens, que se prepara utilizando un proceso de sonicación-centrifugación de dos pasos simple y eficiente en el tiempo. La preparación de extractos de células brutas y la síntesis de proteínas libres de células se pueden lograr en uno o dos días por un solo usuario, lo que permite que esta técnica se integre fácilmente en tuberías para aplicaciones de bioproducción o biología sintética. Para comenzar a lavar un mililitro de la cultura de Vibrio natriegens durante la noche centrifugándolo en una centrífuga de sobremesa a 10,600 veces g durante un minuto.
Aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet, y resuspend en un mililitro de medios frescos LB-V2. Inocular un mililitro de cultivo durante la noche lavado en un litro de medios de crecimiento LB-V2 frescos en un matraz Erlenmeyer de cuatro litros autoclave con cubierta estéril para lograr una ración de dilución de uno a mil. Cultivo de cultivo a 30 grados centígrados mientras se agita a 225 RPM.
Utilice un espectrofotómetro para monitorear las culturas OD 600. Y cuando alcanza 1.0 más o menos 0.2 cosecha el cultivo centrifugando en dos tubos de 500 mililitros a 3,500 veces g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius, y luego colocarlo en hielo. Aspirar el sobrenadante y procesar el pellet inmediatamente.
Antes de iniciar el procedimiento de lysis celular enfriar recién preparado Tólisis tampón pH 7.7 a aproximadamente cuatro grados Celsius, Utilice 10 mililitros de este tampón de lysis S30 frío para re-suspender todos los pellets resultantes del mismo cultivo de un litro. Y transfiera la suspensión a un tubo de 50 mililitros. Centrifugar esta suspensión a 3.500 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y luego aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet y colocarlo sobre hielo.
Trabajando en una sala fría añadir 500 microlitros de tampón de lysis S30 frío al pellet en el tubo de 50 mililitros colocado sobre hielo. Utilice una punta de pipeta de diámetro ancho para resuspender el pellet y transferirlo cuidadosamente a un tubo de dos mililitros también sobre hielo. Con el fin de producir extractos crudos muy activos debemos asegurarnos de que las células no están demasiado diluidas con Tampón S30, pero tienen suficiente líquido para una sonicación eficiente.
Llene un vaso de precipitados de 600 mililitros con hielo y coloque un soporte de tubo de dos mililitros encima del hielo. Vórtice el tubo brevemente para homogeneizar las células. Deslice el dedo para eliminar las células de la parte inferior de la tapa y colóquelo en el soporte del tubo con la tapa abierta.
Punta sonicadora inferior en la suspensión celular en el tubo de modo que esté justo debajo de la superficie líquida. Prepare la configuración de sonicación con un sonicador y una sonda con un diámetro de punta de 1/8 pulgadas. Ajuste el sonicador a una frecuencia de 20 kilohercios y un 50% de amplitud.
Tiempo de pulso de 10 segundos y tiempo de apagado de 60 segundos. Ejecute el protocolo de sonicación de pulsos durante tres ciclos. Y luego centrifugar extracto de células brutas a 16.000 veces g durante 30 a 45 minutos a cuatro grados celsius hasta que el lesate esté libre de cualquier desecho celular.
La inspección visual de la lelisis celular a medida que se lleva a cabo la sonicación es fundamental para garantizar que la sonicación ha funcionado según lo esperado. Trabajando en una sala fría aliquot 50 microlitros de los sobrenadantes resultantes a nuevos tubos de dos mililitros asegurándose de no molestar el pellet. Para congelar el flash estos extractos de células brutas, coloque los tubos en un soporte de tubo con una cuerda de inmersión unida y sumerja en una dewar que contenga nitrógeno líquido y compruebe si está congelado.
Para realizar la expresión de proteínas libres de células utilizando la descongelación de la plantilla de ADN 10X solución de energía mezcla, 4X aminoácidos mezcla maestra alícuotas, y plantilla de ADN a temperatura ambiente. A continuación, retire las existencias de INHIBIDORes de ARN 7 y RNAse del congelador de menos 20 grados Celsius y colóquelos sobre hielo. Una vez que la plantilla de ADN, la mezcla maestra de la solución de energía 10X, y la mezcla maestra de aminoácidos 4X se descongelan, colóquela sobre hielo.
Prepare una mezcla maestra de reacción libre de células agregando cada componente en el orden preciso a un tubo de dos mililitros sobre hielo, y mueva suavemente el tubo después de cada adición a la mezcla maestra. Retire el lysate de la célula bruta de Vibrio natriegens del congelador de menos 80 grados Celsius y colóquelo durante 10 a 20 minutos hasta que se descongele. Agregue el volumen adecuado de extracto de celda bruta descongelada a la mezcla maestra de reacción libre de células y mezcle suavemente con una pipeta.
Para realizar la expresión de proteína libre de células de punto final utilizando termociclo, primero agregue 10 microlitros de la mezcla maestra de reacción libre de células por pozo de la parte inferior de una placa PCR de 96 pozos asegurándose de mezclar la mezcla maestra moviendo el tubo suavemente entre cada transferencia a la placa PCR. Centrifugar la placa a 1.000 g durante 10 segundos para agrupar cualquier mezcla maestra que pueda haber estado pegada a los lados de los pozos. Y luego sellar los pozos con un adhesivo de placa para evitar la evaporación.
Coloque la placa en un termociclador establecido en 26 grados Celsius con una tapa calentada a 105 grados Centígrados. Después de incubar las reacciones en la placa PCR durante un mínimo de tres horas, las proteínas expresadas pueden purificarse, cuantificarse y utilizarse para procesos posteriores. Para monitorear la cinética de expresión de proteína libre de células usando una pipeta lector de placas 10 microlitros por pozo de la mezcla maestra de reacción libre de células en la parte inferior de una placa de ensayo negra de 384 biens con fondos de vidrio transparentes.
Y sellar los pozos con un adhesivo de placa transparente para evitar la evaporación. Coloque la placa de ensayo en un lector de placas a 26 grados Celsius e incubar durante tres a seis horas mientras monitorea las longitudes de onda de excitación/emisión fluorescentes apropiadas correspondientes a la proteína expresada. El sistema de expresión libre de células descrito en este protocolo logra los mejores resultados con una plantilla de ADN plásmido que produce una cantidad significativamente mayor de proteína que la misma cantidad de ADN lineal, como se muestra en los ensayos de punto final y cinético.
También se podría utilizar el ARNm generado por reacciones de transcripción in vitro, pero se requieren mayores cantidades de ARNm. El rendimiento de la producción de proteínas se vio significativamente afectado por la concentración de iones de magnesio y potasio. En condiciones optimizadas se encontró que la concentración óptima de iones de magnesio era de 3,5 milimolares y para el ion de potasio, 80 milimolar.
Por lo tanto, las desviaciones de estas concentraciones iónicas óptimas pueden resultar en una disminución de la capacidad de este sistema de expresión para producir rendimientos significativos de proteínas. Es importante mantener todos los reactivos sobre hielo o trabajar en una sala fría tanto como sea posible. Además, la sonicación adecuada y completa es fundamental para el éxito de este protocolo.
Siguiendo este protocolo los usuarios tendrán la capacidad de expresar proteínas en un formato de alto rendimiento, que se puede utilizar para purificar y detectar la actividad de muchas proteínas diferentes. Esta técnica demuestra el uso de nuevos organismos con propiedades únicas para la expresión libre de células. Vibrio natriegens es una bacteria halófílica de crecimiento rápido que puede ofrecer condiciones únicas para la expresión de proteínas o moléculas pequeñas previamente inexploradas en organismos modelo establecidos.
