Qui, abbiamo stabilito un semplice sistema sperimentale che consente la ricostituzione di complessi di allungamento Pol II attivi adatti per indagare l'accoppiamento funzionale della trascrizione Pol II e del capping dell'RNA. Con questo metodo, i complessi di allungamento funzionale possono essere facilmente assemblati con pochi componenti. I complessi di allungamento sono immobilizzati su perline magnetiche, quindi è facile cambiare le condizioni di reazione.
Per immobilizzare l'oligo di DNA contenente biotina su perline magnetiche, aggiungere prima 200 microlitri di perline magnetiche a un tubo di legame a basso contenuto proteico da 1,5 millilitri, quindi posizionare il tubo su un rack magnetico per due minuti. Mentre il tubo è sul rack magnetico, utilizzare una pipetta per rimuovere il liquido dal tubo senza disturbare le perline. Per lavare le perline, rimuovere il tubo dal rack e aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio contenente Tris-cloridrato, EDTA e cloruro di sodio.
Riportare il tubo al rack. Dopo due minuti, rimuovere la soluzione di lavaggio e ripetere i lavaggi altre due volte utilizzando 200 microlitri dello stesso tampone. Rimospendare le perline magnetiche in 400 microlitri di tampone 2X.
Quindi, aggiungere 380 microlitri di acqua e 20 microlitri di oligo di DNA biotinilato non template da 10 micromolare da mescolare. Posizionare il tubo su un nutator e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le perline con oligo di DNA immobilizzato non template tre volte utilizzando 200 microlitri di tampone e poi tre volte con 200 microlitri di buffer di stoccaggio e diluizione.
Conservare il tubo a quattro gradi Celsius durante la notte per finire di bloccare le perline con BSA. Il giorno dopo, scartare la soluzione, rimpignare le perline in 200 microlitri di tampone di stoccaggio e diluizione, per raggiungere una concentrazione approssimativa di DNA di cinque micromolari, quindi trasferire la soluzione con le perline in un nuovo tubo. Per ottenere il duplex DNA-RNA, preparare una miscela di ricottura a 10 microliter in un tubo PCR con un rapporto molare RNA-DNA due a uno, come descritto nel protocollo scritto.
Posizionare il tubo in un ciclore termico. Impostare il programma su 45 gradi Celsius per cinque minuti, seguito da 12 cicli di due minuti ciascuno, a partire da 43 gradi Celsius e diminuendo la temperatura di due gradi Celsius per ciclo. Infine, mantienilo inattivo a quattro gradi Celsius.
Per caricare l'RNA polimerasi II purificata sull'ibrido DNA-RNA, mescolare un microlitro di DNA-RNA duplex con 13 microlitri di tampone polimerasi II appena preparato in un tubo. Aggiungere un microlitro di RNA polimerasi purificata II e mescolare tubazione delicatamente su e giù e mescolando con la punta della pipetta, senza introdurre bolle. Incubare il tubo per 10 minuti a 30 gradi Celsius.
Per completare il complesso di allungamento, aggiungere un microlitro di perline di oligo di DNA non template immobilizzato a 14 microlitri di tampone di DNA non modello, aggiungere la miscela di 15 microlitri al tubo precedentemente incubato e incubarlo per altri 10 minuti a 37 gradi Celsius. Posizionare il campione sul rack magnetico per due minuti. Lavare il campione una volta con 30 microlitri di tampone di lavaggio per rimuovere la polimerasi II non incorporata e gli oligelli.
Per etichettare via radio i complessi di allungamento con RNA 23mers, aggiungere un microlitro di ATP e un microlitro di UTP radioetichettato a 23 microlitri di tampone di impulsi, e aggiungere questa miscela alle perline magnetiche lavate per riprestare. Incubare la reazione per 10 minuti per consentire la sintesi di 23meri radioetichettati. Aggiungere 1,5 microlitri di soluzione contenenti 100 micromolare ATP e 100 micromolare UTP mix a 3,5 microlitri di chase buffer, e aggiungere la miscela al tubo contenente complessi di allungamento preassemblati su perline.
Ancora una volta, incubare il tubo per cinque minuti per inseguire tutte le trascrizioni nascenti in 23mers. Quindi, posizionare il tubo sul rack magnetico e lavare come è stato fatto in precedenza per rimuovere i nucleotidi non integrati. Resuspend il campione in 30 microlitri di tampone di lavaggio.
Per generare complessi di allungamento con trascrizioni più lunghe, seguire le procedure precedenti e scalare di quattro volte per generare 120 microlitri di complessi di allungamento lavati per quattro reazioni. Etichetta tre nuovi tubi 23mer, 25mer e 29mer. Trasferire 30 microlitri di complessi di allungamento lavati nel tubo 23mer e aggiungere 94 microlitri di mix di arresto contenenti proteinasi K e glicogeno.
Posizionare il tubo contenente i restanti 90 microlitri di complessi di allungamento lavati sul rack magnetico per due minuti, rimuovere il supernatante e rimescolare le perline in 90 microlitri di BTB integrati con 1,2 microlitri di ATP e CTP. Incubare per 10 minuti a 30 gradi Celsius. Dopo il lavaggio con 90 microlitri di tampone di lavaggio, trasferire 30 microlitri di complessi di allungamento al tubo 25mer e aggiungere 94 microlitri di mix di stop contenenti proteinasi K e glicogeno.
Ancora una volta, posizionare il tubo contenente i restanti 60 microlitri di complessi di allungamento sul rack magnetico per due minuti. Ripetere il trattamento BTB con 60 microlitri di tampone integrati con 0,8 microlitri di ATP e CTP. Dopo l'incubazione e il lavaggio come fatto prima, rimorsi il campione in 60 microlitri di tampone di lavaggio.
Trasferire 30 microlitri dal campione al tubo da 29mer e aggiungere 94 microlitri di mix di stop contenenti proteinasi K e glicogeno. Analizzare i prodotti di reazione su un gel di poliacrilammide denaturante. In primo luogo, generare complessi di allungamento lavati contenenti 23mers scalando di 13 volte la procedura precedentemente descritta per ottenere 390 microlitri per 12 reazioni e un extra.
Per eseguire la fosforilazione della TCD della polimerasi II, rimuovere il supernatante dopo aver posizionato il campione nel rack magnetico e rimescolare le perline in 377 microlitri di BTB. Etichettare due nuovi tubi più H e meno H.To più H, aggiungere tre microlitri del fattore di iniziazione alla trascrizione TFIIH alla concentrazione di 300 nanogrammi per microlitro, e a meno H, aggiungere nove microlitri di buffer di stoccaggio e diluizione. Aggiungere 87 microlitri dei complessi di allungamento lavati al tubo più H e 261 microlitri al tubo meno H.
Incubare i tubi per 10 minuti e lavare con tampone di lavaggio. Per eseguire la tappatura dell'RNA, aggiungere 87 microlitri di miscela di tappatura al tubo H più e 261 microlitri al tubo H meno per rimorsi. Etichettare quattro nuovi tubi, cinque più H, cinque meno H, 15 meno H e 45 meno H, e distribuire tre microlitri di cinque, 15 o 45 nanogrammi per microlitri che capping enzima nei tubi corrispondenti.
Quindi, preparare 12 nuovi tubi con 94 microlitri di tampone di arresto. Inizia la prima reazione di tappatura aggiungendo 87 microlitri di complesso di allungamento trattati con TFIIH al tubo etichettato cinque più H.Incubate a 30 gradi Celsius in un blocco termico. Le reazioni di tappatura devono essere cronometrate con precisione utilizzando un cronometro.
Quando si lavora con più reazioni, gli orari di inizio per ogni reazione devono essere scaglionato. Dopo uno, due o quattro minuti, trasferire 30 microlitri della miscela di reazione cinque plus a tubi etichettati uno, due e tre contenenti 94 microlitri di tampone di arresto per fermare le reazioni. Procedere con reazioni di tappatura per i campioni nei restanti tubi meno H esattamente allo stesso modo, utilizzando complessi di allungamento trattati senza TFIIH.
Analizzare i prodotti di reazione su un gel di poliacrilammide denaturante. Un diagramma è mostrato qui per le molecole di DNA e RNA nei complessi di allungamento artificiale. Usando l'oligo di RNA sintetico di 20 nucleotidi come primer RNA durante l'assemblaggio dei complessi di allungamento artificiale, i nucleotidi sono stati aggiunti durante ogni passo sequenziale del protocollo per generare un 23mero, un 25mero e un 29mero.
Sono state confrontate le reazioni che utilizzano RNA polimerasi II da diverse fonti. I complessi di allungamento artificiale sono stati assemblati con polimerasi II endogena di tipo selvatico purificata dal fegato di ratto o dal lievito di fissione e hanno camminato per generare 23mers o 25mers. Un saggio è stato eseguito per misurare la tappatura di trascrizioni radioetiche associate a complessi di allungamento artificiali contenenti 23 trascrizioni nucleotidiche con un'estremità trifosfato a cinque primi.
Le ultime due corsie mostrano i prodotti delle reazioni in cui i complessi di allungamento sono stati incubati con o senza enzima di tappatura in presenza di TFIIH. Le bande di migrazione più lentamente e più rapidamente contengono rispettivamente trascrizioni con punta e non concatena. Le prime 12 corsie mostrano la capping di trascrizioni associate a complessi di allungamento con un CTD fosforilato o non fosforilato.
Le attività della polimerasi II e di altri enzimi possono variare da preparazione a preparazione, quindi è necessario ottimizzare le condizioni di reazione titrating concentrazioni enzimatiche per definire livelli ottimali. È importante usare materiale radioattivo in modo sicuro ed evitare contaminazioni. Assicurati di seguire le linee guida del tuo laboratorio e dell'istituto quando fai esperimenti con la radioattività.
