여기에서, 우리는 Pol II 전사 및 RNA 캡핑의 기능적 결합을 조사하기에 적합한 활성 Pol II 신장 복합체의 재구성을 허용하는 간단한 실험 시스템을 설립했습니다. 이 방법을 사용하면 기능적인 연도 단지를 몇 가지 구성 요소로 쉽게 조립할 수 있습니다. 신장 복합체는 자기 구슬에 고정되어 있어 반응 조건을 쉽게 변경할 수 있습니다.
마그네틱 비드에 비오틴을 함유한 DNA 올리고를 고정하려면 먼저 200 마이크로리터의 마그네틱 비드를 저단백질 결합 1.5 밀리리터 튜브에 추가한 다음 2분 동안 자기 랙에 튜브를 놓습니다. 튜브가 마그네틱 랙에 있는 동안 파이펫을 사용하여 구슬을 방해하지 않고 튜브에서 액체를 제거합니다. 구슬을 세척하려면 랙에서 튜브를 제거하고 트리스 염산염, EDTA 및 염화 나트륨을 포함하는 세척 버퍼 1 밀리리터를 추가하십시오.
튜브를 랙에 반환합니다. 2분 후, 세척 용액을 제거하고 동일한 버퍼의 200 마이크로리터를 사용하여 세척을 두 번 더 반복합니다. 2X 버퍼의 400 마이크로리터에서 자기 구슬을 다시 중단합니다.
그런 다음 380 마이크로리터의 물과 10 마이크로몰라 비템플릿 생체화 DNA 올리고를 혼합하여 첨가합니다. 튜브를 영양사에 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 200 마이크로리터의 완충제를 사용하여 3회 고정된 비템플릿 DNA 올리고로 구슬을 세척한 다음 200마이크로리터의 저장 및 희석 버퍼로 세 번 세척합니다.
BSA로 구슬을 차단 완료 하룻밤 4섭씨에 튜브를 저장합니다. 다음 날, 용액을 폐기하고, 저장 및 희석 버퍼의 200 마이크로 리터에서 구슬을 재연하고, 5 마이크로 몰러의 대략적인 DNA 농도에 도달한 다음 구슬로 용액을 새로운 튜브로 전송한다. DNA-RNA 이중을 얻으려면, 서면 프로토콜에 설명된 바와 같이, 2 대 1 RNA DNA 어금니비로 PCR 튜브에서 10 마이크로리터 어닐링 믹스를 준비한다.
튜브를 열 사이클러에 배치합니다. 프로그램을 섭씨 45도로 5분간 설정하고, 섭씨 43도에서 시작하여 주기당 섭씨 2도까지 12사이클을 기록합니다. 마지막으로, 섭씨 4도에서 유휴 상태로 유지하십시오.
정제된 RNA 폴리머라제 II를 DNA-RNA 하이브리드에 적재하려면 DNA-RNA 이중제 1마이크로리터와 새로 준비된 폴리머라제 II 버퍼 13마이크로리터를 튜브에 혼합한다. 정제 된 RNA 폴리머 라제 II의 마이크로 리터 1 개를 추가하고 거품을 도입하지 않고 부드럽게 위아래로 파이프하고 파이펫 끝으로 저어 혼합합니다. 30도에서 10분 동안 튜브를 배양합니다.
신장 복합체를 완료하려면, 비 템플릿 DNA 버퍼의 14 마이크로 리터에 고정 비 템플릿 DNA 올리고 구슬의 마이크로 리터를 추가, 이전에 인큐베이션 튜브에 15 마이크로 리터 혼합물을 추가하고, 37 섭씨에서 또 다른 10 분 동안 배양. 샘플을 자기 랙에 2분간 놓습니다. 30 마이크로리터의 세척 버퍼로 샘플을 한 번 세척하여 통합되지 않은 폴리머라제 II 및 올리고를 제거합니다.
RNA 23mers로 신장 복합체를 무선으로 표시하려면 ATP의 마이크로리터 1개와 무선 으로 표시된 UTP 의 마이크로리터 1개를 펄스 버퍼 23마이크로리터에 추가하고 세척된 자기 비드에 이 혼합물을 추가하여 재일시 중단합니다. 방사선 표지 23mers의 합성을 허용하기 위해 10 분 동안 반응을 배양. 100 마이크로몰러 ATP 및 100 마이크로몰러 UTP 믹스를 3.5 마이크로리터의 체이스 버퍼에 넣고 구슬에 미리 조립된 연란 복합체를 함유한 튜브에 혼합물을 추가합니다.
다시 말하지만, 튜브를 5 분 동안 배양하여 모든 초기 성적 증명서를 23mers로 쫓아갑니다. 이어서, 튜브를 자기 랙에 놓고, 이전에 수행되었던 것처럼 세척하여 통합되지 않은 뉴클레오티드를 제거한다. 세척 버퍼의 30 마이크로 리터에서 샘플을 다시 일시 중지합니다.
더 긴 성적 증명서와 신장 복합체를 생성하려면, 이전 절차를 따르고, 네 개의 반응에 대한 세척 연신 복합체의 120 마이크로 리터를 생성하기 위해 4 배 확장. 3개의 새로운 튜브 23mer, 25mer 및 29mer라벨. 세척된 연도 복합체 30개소를 23mer 튜브로 옮기고, 단백질제 K와 글리코겐을 함유한 스톱 믹스 94마이크로리터를 첨가한다.
세척된 연신복합체의 나머지 90마이크로리터를 함유한 튜브를 2분 동안 마그네틱 랙에 놓고, 수퍼나탄을 제거하고, ATP와 CTP의 1.2 마이크로리터로 보충된 BTB의 90마이크로리터에서 구슬을 재연한다. 섭씨 30도에서 10분 동안 배양하세요. 90 마이크로리터의 세척 버퍼로 세척한 후, 30마이크로리터의 연도 복합체를 25mer 튜브로 옮기고, 단백질제 K와 글리코겐을 함유한 스톱 믹스 94마이크로리터를 추가한다.
다시 말하지만, 2 분 동안 자기 랙에 신장 복합체의 나머지 60 마이크로 리터를 포함하는 튜브를 배치합니다. ATP및 CTP의 0.8 마이크로리터로 보충된 60마이크로리터의 완충제로 BTB 처리를 반복하십시오. 이전과 마찬가지로 배양 및 세척 후 60 마이크로리터의 세척 버퍼로 샘플을 다시 중단하십시오.
샘플에서 29mer 튜브로 마이크로리터 30편을 옮기고, 단백질제 K와 글리코겐을 함유한 스톱 믹스 94마이크로리터를 첨가한다. 탈고 폴리 아크릴아미드 젤에 반응 제품을 분석합니다. 먼저, 이전에 설명된 시술을 13배 까지 확장하여 23mers를 함유한 세척 된 연신 복합체를 생성하여 12 반응 및 1 개의 추가 반응에 대해 390 마이크로 리터를 획득합니다.
폴리머라제 II CTD의 인산화를 수행하기 위해, 마그네틱 랙에 샘플을 배치 한 후 상퍼 를 제거하고 BTB의 377 마이크로 리터에서 구슬을 재연. 두 개의 새로운 튜브 플러스 H와 마이너스 H.To 플러스 H를 라벨, 마이크로 리터 당 300 나노 그램의 농도에 전사 개시 인자 TFIIH의 세 마이크로 리터를 추가하고, 마이너스 H에, 저장 및 희석 버퍼의 9 마이크로 리터를 추가합니다. 세척된 연도 단지 87개와 H 튜브 261마이크로리터를 마이너스 H 튜브에 추가합니다.
튜브를 10분 동안 배양하고 세척 버퍼로 세척합니다. RNA 캡핑을 수행하려면 87 마이크로리터의 캡핑 믹스를 플러스 H 튜브에 추가하고 261 마이크로리터를 마이너스 H 튜브에 추가하여 다시 중단합니다. 4개의 새로운 튜브, 5개의 플러스 H, 5마이너스 H, 15 마이너스 H, 45 마이너스 H, 및 마이크로리터 캡핑 효소당 5, 15 또는 45 나노그램의 3개의 마이크로리터를 분배합니다.
그런 다음 정지 버퍼 94 마이크로 리터로 12 개의 새로운 튜브를 준비하십시오. 열 블록에서 섭씨 30도에 5플러스 H.Incubate로 표시된 튜브에 TFIIH로 처리된 87마이크로리터의 신장 복합체를 추가하여 첫 번째 캡핑 반응을 시작합니다. 스톱워치를 사용하여 캡핑 반응을 정확하게 시간 조정해야 합니다.
여러 반응으로 작업할 때 각 반응의 시작 시간은 엇갈려야 합니다. 1, 2, 4분 후, 5개의 플러스 반응 혼합물 의 30마이크로리터를 1개, 2, 3개의 튜브에 전달하여 94마이크로리터의 스톱 버퍼를 함유하여 반응을 중지한다. TFIIH 없이 처리된 신장 복합체를 사용하여, 정확히 동일한 방식으로 나머지 마이너스 H 튜브의 샘플에 대한 상한 반응을 진행한다.
탈고 폴리 아크릴아미드 젤에 반응 제품을 분석합니다. 다이어그램은 인공 신장 복합체에서 DNA 및 RNA 분자를 위해 여기에 표시됩니다. 20개의 뉴클레오티드의 합성 RNA 올리고를 인공 신장 복합체의 조립 시 RNA 프라이머로 사용하였으며, 23mer, 25mer 및 29mer를 생성하는 프로토콜의 각각순차적 보행 단계에서 뉴클레오티드가 첨가되었다.
상이한 소스로부터 RNA 폴리머라제 II를 이용한 반응을 비교했다. 인공 신장 복합체는 쥐 간 또는 핵분열 효모로부터 정제된 내인성, 야생형 폴리머라제 II로 조립되어 23mers 또는 25mers를 생성하기 위해 걸어갔다. 분석은 5-프라임 triphosphate 끝을 가진 23개의 뉴클레오티드 녹취록을 포함하는 인공 신장 복합체와 관련되었던 방사선 표지된 녹취록의 상한을 측정하기 위하여 수행되었습니다.
마지막 두 차선은 TFIIH의 존재시 에 있는 효소의 유무에 관계없이 신장 복합체가 배양되거나 없이 배양된 반응의 제품을 보여줍니다. 더 느리고 빠르게 마이그레이션하는 밴드는 각각 캡및 제한되지 않은 성적 증명서를 포함합니다. 처음 12 차선은 인광 또는 unphosphorylated CTD와 신장 복합체와 관련된 성적 증명서의 상한을 보여줍니다.
폴리머라제 II 및 기타 효소의 활동은 준비에 따라 다를 수 있으므로 효소 농도를 적정하여 최적의 수준을 정의하여 반응 조건을 최적화할 필요가 있습니다. 방사성 물질을 안전하게 사용하고 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 방사능 실험을 할 때 실험실 및 종교 교육원 지침을 따르십시오.
