ここでは、Pol II転写とRNAキャッピングの機能的結合の調査に適したアクティブなPol II伸長複合体の再構成を可能にする簡単な実験システムを確立しました。この方法を使用すると、機能伸び複合体は、わずか数個のコンポーネントで簡単に組み立てることができます。伸びの複合体は磁気ビーズに固定化されるので、反応条件を変えやすい。
磁気ビーズにビオチンを含むDNAオリゴを固定化するには、まず200マイクロリットルの磁気ビーズを低タンパク質結合1.5ミリリットルチューブに加え、次に2分間磁気ラックにチューブを置きます。チューブが磁気ラックにある間、ピペットを使用してビーズを邪魔することなくチューブから液体を取り除きます。ビーズを洗浄するには、ラックからチューブを取り出し、トリス塩酸塩、EDTA、塩化ナトリウムを含む洗浄バッファーを1ミリリットル加えます。
チューブをラックに戻します。2分後、洗浄液を取り出し、同じバッファーの200マイクロリットルを使用してさらに2回洗浄を繰り返します。磁気ビーズを400マイクロリットルの2Xバッファーに再懸濁します。
次に、380マイクロリットルの水と10マイクロモル非鋳型ビオチン化DNAオリゴの20マイクロリットルを加え、混合します。チューブをヌテーターに置き、室温で30分間インキュベートします。その後、200マイクロリットルのバッファーを使用して固定化された非鋳型DNAオリゴでビーズを3回洗浄し、200マイクロリットルの貯蔵および希釈バッファーで3回洗浄します。
BSAでビーズをブロックし終えるために一晩摂氏4度でチューブを保管してください。翌日、溶液を廃棄し、200マイクロリットルの貯蔵および希釈バッファーでビーズを再懸濁し、5マイクロモルの近似DNA濃度に達し、次にビーズと共に溶液を新しいチューブに移す。DNA-RNA二重を得るために、書かれたプロトコルに記載されているように、2対1のRNA-DNAモル比を有するPCRチューブに10マイクロリットルのアニーリングミックスを調製する。
チューブをサーマルサイクラーに入れます。プログラムを摂氏45度に設定し、次にそれぞれ2分間の12サイクルを摂氏43度から始め、1サイクルあたり2度の温度を下げます。最後に、摂氏4度でアイドル状態に保ちます。
精製されたRNAポリメラーゼIIをDNA-RNAハイブリッドにロードするには、DNA-RNAデュプレックスの1マイクロリットルを、13マイクロリットルの新しく調製したポリメラーゼIIバッファーをチューブに混合します。精製されたRNAポリメラーゼIIの1マイクロリットルを加え、気泡を導入することなく、上下に軽くピペットをピペット化し、ピペットチップで攪拌して混ぜます。チューブを摂氏30度で10分間インキュベートします。
伸長複合体を完成させるために、固定化された非鋳型DNAオリゴビーズの1マイクロリットルを非鋳型DNAバッファーの14マイクロリットルに加え、以前インキュベートされたチューブに15マイクロリットルの混合物を加え、さらに10分間摂氏37度でインキュベートします。サンプルを磁気ラックに2分間置きます。30マイクロリットルの洗浄バッファーでサンプルを1回洗い、非組み込みポリメラーゼIIおよびオリゴを除去します。
RNA 23mersで伸び複合体に放射標識を付けるには、23マイクロリットルのパルスバッファーにATPの1マイクロリットルと1マイクロリットルの放射標識されたUTPを加え、この混合物を洗浄された磁気ビーズに加え再懸濁液にします。反応を10分間インキュベートし、23mersの放射標識合成を可能にする。100マイクロモルATPと100マイクロモルUTPミックスを含む溶液1.5マイクロリットルを3.5マイクロリットルのチェイスバッファに加え、ビーズ上にあらかじめ組み立てた伸び物を含むチューブに混合物を加えます。
繰り返しますが、チューブを5分間インキュベートして、すべての新生転写物を23mersに追いかけます。次いで、チューブを磁気ラックの上に置き、以前に行ったように洗浄して、非法人ヌクレオチドを除去する。30マイクロリットルの洗浄バッファーでサンプルを再懸濁します。
より長い転写物を伴う伸び複合体を生成するには、前の手順に従い、4倍にスケールアップして、4つの反応に対して120マイクロリットルの洗浄された伸長複合体を生成する。ラベル3つの新しいチューブ23mer、25mer、および29mer。洗浄された伸び複合体の30マイクロリットルを23merチューブに移し、プロテナーゼKとグリコーゲンを含むストップミックスの94マイクロリットルを加える。
残りの90マイクロリットルの洗浄された伸び複合体を含むチューブを磁気ラックに2分間置き、上清を取り除き、1.2マイクロリットルのATPとCTPを補充したBTBの90マイクロリットルでビーズを再懸濁します。摂氏30度で10分間インキュベートします。90マイクロリットルの洗浄バッファーで洗浄した後、30マイクロリットルの伸び複合体を25merチューブに移し、プロテイナーゼKとグリコーゲンを含むストップミックスの94マイクロリットルを加えます。
再度、残りの60マイクロリットルの伸び複合体を含むチューブを磁気ラックに2分間置きます。ATPおよびCTPの0.8マイクロリットルで補われた緩衝液の60マイクロリットルでBTB処理を繰り返す。前に行ったようにインキュベーションと洗浄後、60マイクロリットルの洗浄バッファーでサンプルを再懸濁します。
サンプルから29merチューブに30マイクロリットルを移し、プロテイナーゼKとグリコーゲンを含むストップミックスの94マイクロリットルを加えます。変性ポリアクリルアミドゲルで反応生成物を分析します。まず、先に説明した手順を13倍にスケールアップして23マーを含む洗浄伸長複合体を生成し、12回の反応と1回の追加反応に対して390マイクロリットルを得る。
ポリメラーゼII CTDのリン酸化を行うために、試料を磁気ラックに入れた後に上清を取り除き、BTBの377マイクロリットルでビーズを再懸濁する。2つの新しいチューブにHとマイナスH.ToプラスHを加え、1マイクロリットル当たり300ナノグラムの濃度で転写開始因子TFIIHの3マイクロリットルを追加し、マイナスHに9マイクロリットルの貯蔵および希釈バッファーを追加します。プラスHチューブに87マイクロリットルの洗浄された伸び複合体を加え、マイナスHチューブに261マイクロリットルを加えます。
チューブを10分間インキュベートし、洗浄バッファーで洗浄します。RNAキャッピングを行う場合は、プラスHチューブにキャッピングミックス87マイクロリットル、マイナスHチューブに261マイクロリットルを加えて再懸濁します。4つの新しいチューブ、5プラスH、5マイナスH、15マイナスH、45マイナスHにラベルを付け、マイクロリットルキャッピング酵素あたり5、15、または45ナノグラムの3マイクロリットルを対応するチューブに分配します。
次に、94マイクロリットルの停止バッファーを備えた12個の新しいチューブを準備します。TFIIHで処理した87マイクロリットルの伸び複合体を、ヒートブロック内の摂氏30度で5プラスH.Incubateとラベル付けしたチューブに加えて、最初のキャッピング反応を開始します。キャッピング反応は、ストップウォッチを使用して正確にタイミングを合わせたものである必要があります。
複数の反応を処理する場合、各反応の開始時間はずらされるべきです。1、2、または4分後、5プラス反応混合物の30マイクロリットルを、1、2、および3個のストップバッファーを含む1、2、および3を標識したチューブに移し、反応を停止する。TFIIHなしで処理された伸び複合体を使用して、全く同じ方法で残りのマイナスHチューブ内のサンプルのキャッピング反応を進めます。
変性ポリアクリルアミドゲルで反応生成物を分析します。人工伸長複合体におけるDNAおよびRNA分子の図をここに示す図。人工伸長複合体の組立時にRNAプライマーとして20ヌクレオチドの合成RNAオリゴを用い、プロトコルの各逐次歩行工程中にヌクレオチドを加え、23mer、25mer、および29merを生成した。
異なる供給源からのRNAポリメラーゼIIを用いた反応を比較した。人工伸長複合体は、ラット肝臓または分裂酵母のいずれかから精製された内在性の野生型ポリメラーゼIIで組み立てられ、23mersまたは25mersを生成するために歩いた。アッセイを行い、5素数の三リン酸末端を有する23個のヌクレオチド転写物を含む人工伸長複合体に関連する放射標識された転写物のキャッピングを測定した。
最後の2つのレーンは、TFIIHの存在下で酵素をキャッピングの有無にかかわらず伸長複合体がインキュベートされた反応の産物を示しています。よりゆっくりとより急速に移行するバンドには、それぞれ上限付きトランスクリプトと上限なしのトランスクリプトが含まれています。最初の12レーンは、リン酸化またはリン酸化されていないCTDを有する伸び複合体に関連する転写物のキャッピングを示す。
ポリメラーゼIIと他の酵素の活性は準備から準備に異なる場合がありますので、最適なレベルを定義するために酵素濃度を滴定することによって反応条件を最適化する必要があります。放射性物質を安全に使用し、汚染を避けることは重要です。放射能実験を行う際は、必ず研究室や研究所のガイドラインに従ってください。
