Hier haben wir ein einfaches experimentelles System etabliert, das die Rekonstitution aktiver Pol II Dehnungskomplexe ermöglicht, die für die Untersuchung der funktionellen Kopplung von Pol II Transkription und RNA-Kappung geeignet sind. Mit dieser Methode lassen sich funktionale Dehnungskomplexe einfach mit wenigen Komponenten zusammenbauen. Die Dehnungskomplexe sind auf magnetischen Perlen immobilisiert, so dass es einfach ist, Reaktionsbedingungen zu ändern.
Um DNA-Oligo, das Biotin enthält, auf magnetischen Perlen zu immobilisieren, fügen Sie zunächst 200 Mikroliter Magnetperlen in eine proteinarme, bindende 1,5-Milliliter-Röhre ein und legen Sie die Röhre dann für zwei Minuten auf ein magnetisches Rack. Während sich das Rohr auf dem magnetischen Rack befindet, verwenden Sie eine Pipette, um die Flüssigkeit aus dem Rohr zu entfernen, ohne die Perlen zu stören. Um die Perlen zu waschen, entfernen Sie das Rohr aus dem Rack, und fügen Sie einen Milliliter Waschpuffer mit Tris-Hydrochlorid, EDTA und Natriumchlorid hinzu.
Geben Sie das Rohr in das Rack zurück. Nach zwei Minuten die Waschlösung entfernen und die Wäsche zwei weitere Male mit 200 Mikroliter n.A. desselben Puffers wiederholen. Setzen Sie die magnetischen Perlen in 400 Mikroliter 2X Puffer aus.
Dann fügen Sie 380 Mikroliter Wasser und 20 Mikroliter 10-Mikromolar nicht-Schablone biotinylierte DNA-Oligo zu mischen. Legen Sie das Rohr auf einen Nutator und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Danach die Perlen mit immobilisiertem DNA-Oligo dreimal mit 200 Mikroliter Puffer und dann dreimal mit 200 Mikroliter Lagerung und Verdünnungspuffer waschen.
Bewahren Sie die Röhre über Nacht bei vier Grad Celsius auf, um die Beads mit BSA zu blockieren. Am nächsten Tag entsorgen Sie die Lösung, setzen Sie die Perlen in 200 Mikroliter Lagerung und Verdünnungspuffer wieder auf, um eine ungefähre DNA-Konzentration von fünf Mikromolaren zu erreichen, und übertragen Sie die Lösung dann mit den Perlen in ein neues Rohr. Um das DNA-RNA-Duplex zu erhalten, bereiten Sie eine 10-Mikroliter-Glühmischung in einer PCR-Röhre mit einem Zwei-zu-Eins-RNA-DNA-Molar-Verhältnis vor, wie im geschriebenen Protokoll beschrieben.
Legen Sie das Rohr in einen thermischen Cycler. Stellen Sie das Programm für fünf Minuten auf 45 Grad Celsius, gefolgt von 12 Zyklen zu je zwei Minuten, beginnend bei 43 Grad Celsius und einer Senkung der Temperatur um zwei Grad Celsius pro Zyklus. Schließlich halten Sie es untätig bei vier Grad Celsius.
Um gereinigte RNA-Polymerase II auf den DNA-RNA-Hybrid zu laden, mischen Sie einen Mikroliter DNA-RNA-Duplex mit 13 Mikroliterfrisch zubereitetem Polymerase-II-Puffer in einer Röhre. Fügen Sie einen Mikroliter gereinigte RNA-Polymerase II hinzu und mischen Sie sie, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen und mit der Pipettenspitze rühren, ohne Blasen einzuschleusen. Inkubieren Sie die Röhre für 10 Minuten bei 30 Grad Celsius.
Um den Dehnungskomplex zu vervollständigen, fügen Sie einen Mikroliter immobilisierter DNA-Oligoperlen, die nicht in schablonierten DNA-Gerüchen, 14 Mikroliter nicht-Template-DNA-Puffer hinzu, fügen Sie die 15-Mikroliter-Mischung in die zuvor inkubierte Röhre ein und inkubieren Sie sie für weitere 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Legen Sie die Probe für zwei Minuten auf das Magnetgestell. Waschen Sie die Probe einmal mit 30 Mikroliter Waschpuffer, um nicht inkorporierte Polymerase II und Oligos zu entfernen.
Um die Dehnungskomplexe mit RNA 23mers radioaktiv zu kennzeichnen, fügen Sie einen Mikroliter ATP und einen Mikroliter radioaktiv markierte UTP zu 23 Mikroliter Pulspuffer hinzu, und fügen Sie diese Mischung zu den gewaschenen Magnetperlen hinzu, um sie wieder aufzusetzen. Inkubieren Sie die Reaktion für 10 Minuten, um die Synthese von radioaktiv markierten 23mers zu ermöglichen. Fügen Sie 1,5 Mikroliter Lösung mit 100-Mikromolar ATP und 100-Mikromolar-UTP-Mischung zu 3,5 Mikroliter Njekpuffer hinzu und fügen Sie die Mischung in das Rohr mit vormontierten Dehnungskomplexen auf Perlen hinzu.
Wieder, inkubieren Sie die Röhre für fünf Minuten, um alle aufkeimenden Transkripte in 23mers zu jagen. Legen Sie dann das Rohr auf das magnetische Rack und waschen Sie, wie zuvor getan wurde, um nicht inkorporierte Nukleotide zu entfernen. Setzen Sie die Probe in 30 Mikroliter Waschpuffer aus.
Um Dehnungskomplexe mit längeren Transkripten zu erzeugen, folgen Sie den vorherigen Verfahren und skalieren Sie sich vervierfachen, um 120 Mikroliter gewaschener Dehnungskomplexe für vier Reaktionen zu erzeugen. Beschriften Sie drei neue Rohre 23mer, 25mer und 29mer. Übertragen Sie 30 Mikroliter gewaschener Dehnungskomplexe in das 23mer-Rohr und fügen Sie 94 Mikroliter Stop-Mix hinzu, der Proteinase K und Glykogen enthält.
Legen Sie das Rohr mit den restlichen 90 Mikrolitern gewaschener Dehnungskomplexe für zwei Minuten auf das magnetische Rack, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie Perlen in 90 Mikroliter BTB auf, ergänzt mit 1,2 MikroliterAT und CTP. 10 Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren. Nach dem Waschen mit 90 Mikroliter Waschpuffer 30 Mikroliter Dehnungskomplexe in das 25mer-Rohr geben und 94 Mikroliter Stop-Mix mit Proteinase K und Glykogen hinzufügen.
Legen Sie das Rohr mit den restlichen 60 Mikroliterdehnungskomplexen erneut zwei Minuten lang auf das Magnetgestell. Wiederholen Sie die BTB-Behandlung mit 60 Mikroliter Puffer, ergänzt mit 0,8 MikroliterAT und CTP. Nach dem Inkubieren und Waschen wie zuvor, die Probe in 60 Mikroliter Waschpuffer wieder aussetzen.
Übertragen Sie 30 Mikroliter aus der Probe in das 29mer-Röhrchen und fügen Sie 94 Mikroliter Stop-Mix mit Proteinase K und Glykogen hinzu. Analysieren Sie Reaktionsprodukte auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Erstellen Sie zunächst gewaschene Dehnungskomplexe mit 23Mern, indem Sie das zuvor beschriebene Verfahren um das 13-fache skalieren, um 390 Mikroliter für 12 Reaktionen und ein Extra zu erhalten.
Um die Phosphorylierung der Polymerase II CTD durchzuführen, entfernen Sie den Überstand, nachdem Sie die Probe in das magnetische Rack gestellt haben, und setzen Sie die Perlen in 377 Mikroliter BTB wieder aus. Zwei neue Tuben plus H und minus H.To plus H beschriften, drei Mikroliter Transkriptionsinitiierungsfaktor TFIIH in der Konzentration von 300 Nanogramm pro Mikroliter hinzufügen und auf minus H neun Mikroliter Lagerung und Verdünnungspuffer hinzufügen. Fügen Sie 87 Mikroliter der gewaschenen Dehnungskomplexe in das Plus H-Rohr und 261 Mikroliter in das Minus H-Rohr.
Die Schläuche 10 Minuten lang bebrüten und mit Waschpuffer waschen. Um die RNA-Verkappung durchzuführen, fügen Sie 87 Mikroliter Verschließmischung in die Plus-H-Röhre und 261 Mikroliter in die Minus-H-Röhre ein, um sie wieder aufzusetzen. Etikettieren Sie vier neue Tuben, fünf plus H, fünf minus H, 15 minus H und 45 minus H, und geben Sie drei Mikroliter fünf, 15 oder 45 Nanogramm pro Mikroliter Verschließungsenzym in die entsprechenden Röhrchen.
Dann bereiten Sie 12 neue Rohre mit 94 Mikroliter Stop-Puffer. Beginnen Sie die erste Verkappungsreaktion, indem Sie 87 Mikroliter Dehnungskomplex, der mit TFIIH behandelt wird, in das mit fünf plus H.Inkubte bei 30 Grad Celsius beschriftete Rohr in einem Wärmeblock hinzufügen. Die Kappungsreaktionen müssen mit einer Stoppuhr präzise getimt werden.
Bei der Arbeit mit mehreren Reaktionen sollten die Startzeiten für jede Reaktion gestaffelt sein. Nach einer, zwei oder vier Minuten 30 Mikroliter der fünf Plus-Reaktionsmischung in Röhren mit der Bezeichnung eins, zwei und drei mit 94 Mikroliter Stopppuffer übertragen, um die Reaktionen zu stoppen. Gehen Sie mit Verschlussreaktionen für die Proben in den verbleibenden Minus H-Röhren genau auf die gleiche Weise vor, wobei Dehnungskomplexe ohne TFIIH behandelt werden.
Analysieren Sie Reaktionsprodukte auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel. Ein Diagramm für DNA- und RNA-Moleküle in künstlichen Dehnungskomplexen ist hier dargestellt. Mit dem synthetischen RNA-Oligo von 20 Nukleotiden als RNA-Primer während der Montage der künstlichen Dehnungskomplexe wurden bei jedem sequenziellen Schritt des Protokolls Nukleotide hinzugefügt, um ein 23mer, ein 25mer und ein 29mer zu erzeugen.
Reaktionen mit RNA-Polymerase II aus verschiedenen Quellen wurden verglichen. Künstliche Dehnungskomplexe wurden mit endogener, wildartiger Polymerase II zusammengesetzt, die entweder aus Rattenleber oder Spalthefe gereinigt und zu 23Mern oder 25Mern geführt wurden. Ein Test wurde durchgeführt, um die Deckelung von radioaktiv markierten Transkripten zu messen, die mit künstlichen Dehnungskomplexen verbunden sind, die 23 Nukleotid-Transkripte mit einem Fünf-Prime-Triphosphat-Ende enthalten.
Die letzten beiden Bahnen zeigen die Produkte von Reaktionen, in denen Dehnungskomplexe in Gegenwart von TFIIH mit oder ohne Verschlussenzym inkubiert wurden. Die langsameren und schneller migrierenden Bänder enthalten gedeckelte bzw. ungekapselte Transkripte. Die ersten 12 Bahnen zeigen die Deckelung von Transkripten, die mit Dehnungskomplexen mit einer phosphorylierten oder nicht phosphorylierten CTD verbunden sind.
Aktivitäten von Polymerase II und anderen Enzymen können von Vorbereitung bis Vorbereitung variieren, so dass es notwendig ist, Reaktionsbedingungen durch Titrierung von Enzymkonzentrationen zu optimieren, um optimale Niveaus zu definieren. Es ist wichtig, radioaktives Material sicher zu verwenden und Kontaminationen zu vermeiden. Bitte beachten Sie bei Experimenten mit Radioaktivität Die Richtlinien Ihres Labors und Instituts.
