Bu teknik, mikroorganizmaların hızlı ve yüksek verimli moleküler tabanlı teknikler kullanarak son derece benzer suşların karışık popülasyonundan doğru ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Sonuçta, suşları arasında yapılacak fitness karşılaştırmalar sağlayan. Tek bir havuzda aynı anda birçok suşları değerlendirme yeteneği, tüm suşları tam olarak aynı koşullara maruz olduğu için iyi-to-well veya organizma-organizma değişkenliğini önemli ölçüde azaltır.
Bu tekniğin uyarlanabilirliği, neredeyse genetik olarak şekillendirilebilir organizmalar ve mikropların doğru bir şekilde ölçülmesi gereken neredeyse tüm deneysel tasarımlar için kullanılmasını sağlar. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi, bakteri kromozomları üzerine genetik belirteçlerin mühendisliği ile başlayın. Biri hariç her barkodu içeren genomik DNA havuzu oluşturun.
Tek kalan barkod içeren genomik DNA ile seyreltme serisi gerçekleştirmek için seyreltici olarak bu havuzu kullanın. Prob tabanlı kimya için tasarlanmış bir dijital PCR supermix kullanmak için üreticinin önerilerine göre yinelenen dijital PCR için reaksiyonlar hazırlayın. Şablon DNA olarak birleştirilmiş genomik DNA'yı kullanın.
Ayrıca, metin protokolünde açıklandığı gibi 20 X primer sondası Master Mix ekleyin. Üreticinin önerilerine göre dijital PCR için çoğaltma kontrol reaksiyonları hazırlayın. Her sonda karışımı için denetim reaksiyonları Şablon yok denetimleri, negatif denetimler ve pozitif denetimlerden oluşmalıdır.
Her barkodlu genomik DNA örneği için dijital PCR reaksiyonları oluşturmak için bu adımları tekrarlayın. Üreticinin talimatlarına göre, bir damlacık jeneratör kullanarak her reaksiyon durumu için damlacıklar oluşturun. Yeni oluşturulan damlacıkları uygun 96 kuyu plakasına aktarın.
5 ile 50 mikrolitre lik çok kanallı pipette 200 mikrolitre lik pipet ucu kullanın. Tüm damlacıklar üretilip transfer edildikten sonra, plakayı folyo plakalı bir mühürle kapatın. Üretici bisiklet koşullarını gerçekleştirmek için termal döngücün tavsiye sini kullanın.
Termobisiklet yapılırken, veri analiz yazılımını örnek ad, deneme türü ve supermix gibi plaka kurulum bilgileriyle programlayın. Ayrıca Hedef 1 adı ve Hedef 1 türünün yanı sıra Hedef 2 adı ve Hedef 2 türünü de içerir. Termobisiklet tamamlandıktan sonra, tamamlanan reaksiyonları damlacık okuyucuya aktarın ve üreticinin talimatlarına göre okuma işlemini başlatın.
Tüm kuyular okunduğunda ve çalışma tamamlandığında, veri çözümleme yazılımını kullanarak QLP veri dosyasını açın. Aynı astar sondası Mastermix kullanan tüm kuyuları seçin. Damlacıklar sekmesinde, hem pozitif hem de negatif damlacıklar da dahil olmak üzere her kuyuda analiz edilen damlacıkların sayısını inceleyin.
10.000 toplam damlacıktan daha az olan kuyuları analizden hariç tut. 1B Genlik sekmesine geçin ve pozitif ve negatif damlacıkların genliklerini inceleyin. 2 farklı popülasyondan oluştuğundan emin olun.
Yazılım içinde, kullanılan her sonda için pozitif ve negatif damlacıklar arasında bir kesme yapmak için eşik özelliğini kullanın. Tüm kuyulara uygun eşikler uygulandıktan sonra, yazılım her reaksiyondaki DNA kopyalarının sayısını hesaplar. Daha fazla analiz kolaylaştırmak için verileri elektronik tabloya aktarın.
Bu değerleri kullanarak, örnekteki her bir benzersiz genomik barkodun ilk kopya numarasını hesaplayın. Negatif kontrol reaksiyonlarından ortalama yanlış pozitif oranı belirleyin ve bu değeri deneysel reaksiyonlarda elde edilen değerlerden çıkarın. Her denemeyi kurarken yapılan seyreltmelere göre değerleri gerektiği gibi çarpın.
Şimdi, rekabetçi endeksi hesaplayarak bir organizmanın göreceli uygunluğunu belirleyin veya barkodlu suş dijital PCR tabanlı niceleme rekabet endeksi iptal. Her zaman noktalarında her barkodlu zorlanma için bu adımı gerçekleştirin. AA barkodu içeren genomik DNA diğer tüm barkodlu genomik DNA'nın arka planında seyreltildi.
Kanal 1, AA barkodiçin FAM sondasını, Kanal 2 ise AO barkod için HEX sondasını temsil eder. Her sondanın sonuçları hem tek tek damlacık floresan genliği hem de seçilen kuyularda bulunan tüm damlacıkların floresan yoğunluğunun sıklığını temsil eden bir histogram olarak sunulur. Her durum için pozitif ve negatif damlacıklar 2 ayrı popülasyon oluşturmalıdır.
Popülasyonlar pozitif ve negatif damlacıkları tanımlamak için eşiközelliği kullanılarak ayrılmalıdır. Eşik değerleri kullanılan problara bağlı olarak değişir, ancak aynı prob karışımını kullanan tüm kuyular aynı eşiklere sahip olmalıdır. Seyreltilmiş AA durumunda, histogram pozitif damlacıklar önemli ölçüde negatif damlacıklar tarafından sayıca az olduğu için sadece tek popülasyon tasvir görünür.
Ancak, 2 farklı popülasyon lar sol panellerde damlacık floresan genliği inceleyerek hala görülebilir. AA barkodlu genomik DNA seyreltildikçe pozitif damlacıklarda azalma oldu, pozitif AO damlacıklarının sayısı sabit kaldı. Tüm kuyulara uygun eşikler uygulandıktan sonra yazılım her reaksiyondaki DNA kopyalarının sayısını hesaplar.
Araştırmanızın bir parçası olarak rutin olarak PCR yaparsanız, model organizmanızın zindeliğini değerlendirmek için bu tekniği gerçekleştirebilirsiniz. Bu yordam normalde upstream deneylerin sonunda sonuçlarını belirlemek için kullanılır. Onun gerçek yarar bakteriyel nicelik güveniyor herhangi bir deney için kolaylık ve çok yönlülük teşvik etmektir.
Biz enfeksiyon bir murine modelisalmonella fitness değerlendirmek için bu tekniği kullanıyoruz. Ayrıca bu teknik laboratuvarımızda diğer patojen mikroorganizmalarla kullanılmak üzere uyarlanmaktadır.
