Esta técnica permite quantificação precisa e precisa de microrganismos de uma população mista de cepas altamente semelhantes usando técnicas de base molecular rápida e de alto rendimento. Em última análise, ao permitir comparações de aptidão a ser feitas entre as cepas. A capacidade de avaliar simultaneamente muitas cepas em uma única piscina reduz substancialmente a variabilidade bem-para-bem ou organismo-organismo-organismo porque todas as cepas estão expostas precisamente às mesmas condições.
A adaptabilidade desta técnica permite que ela seja usada para quase qualquer organismo geneticamente maleável e quase qualquer design experimental que exija quantificação precisa de micróbios. Inicie este procedimento com a engenharia de marcadores genéticos em cromossomos bacterianos, conforme descrito no protocolo de texto. Crie um pool de DNA genômico que contenha todos os códigos de barras, exceto um.
Use esta piscina como diluente para realizar uma série de diluição com DNA genômico contendo o único código de barras restante. Prepare reações para PCR digital em duplicata de acordo com as recomendações do fabricante para o uso de um supermix PCR digital projetado para química baseada em sonda. Use o DNA genômico agrupado como DNA modelo.
Além disso, adicione o primer de 20 X master Mix, conforme descrito no protocolo de texto. Prepare reações de controle de réplica para PCR digital de acordo com as recomendações do fabricante. As reações de controle para cada mix de sonda devem consistir em controles de modelo, controles negativos e controles positivos.
Repita essas etapas para criar reações digitais de PCR para cada amostra de DNA genômica com código de barras. Gerar gotículas para cada condição de reação usando um gerador de gotículas, de acordo com as instruções do fabricante. Transfira gotículas recém-criadas para a placa de poço 96 apropriada.
Use 200 dicas de pipeta de microliter em uma pipeta multicanal de 5 a 50 microliter. Depois de todas as gotículas terem sido geradas e transferidas, sele a placa com um selador de placa de papel alumínio. Use o ciclo térmico recomendado pelo fabricante para realizar as condições de ciclismo.
Enquanto o termociclismo está sendo realizado, programe o software de análise de dados com as informações de configuração da placa, como nome da amostra, tipo de experimento e Supermix usado. Também incluem o nome do Alvo 1 e o tipo Target 1, bem como o nome do Alvo 2 e o tipo Target 2. Após a conclusão do termociclismo, transfira as reações completas ao leitor de gotículas e inicie o processo de leitura, de acordo com as instruções do fabricante.
Quando todos os poços tiverem sido lidos e a execução estiver concluída, abra o arquivo de dados QLP usando o software de análise de dados. Selecione todos os poços que utilizam a mesma sonda primer Mastermix. Na guia Gotículas, examine o número de gotículas analisadas em cada poço, incluindo gotículas positivas e negativas.
Exclua da análise qualquer poço que seja inferior a 10.000 gotículas totais. Mova-se para a aba Amplitude 1D e examine as amplitudes das gotículas positivas e negativas. Certifique-se de que eles compreendem 2 populações distintas.
Dentro do software, use o recurso de limiar para fazer um corte entre gotículas positivas e negativas para cada sonda utilizada. Uma vez aplicados limites apropriados a todos os poços, o software calculará o número de cópias de DNA em cada reação. Exportar dados para uma planilha para facilitar uma análise mais aprofundada.
Usando esses valores, calcule o número inicial de cópia de cada código de barras genômico único na amostra. Determine a taxa média de falso positivo das reações de controle negativos e subtraia esse valor dos valores obtidos em reações experimentais. Multiplique os valores conforme necessário, com base nas diluições que foram realizadas na configuração de cada experimento.
Agora, determine a aptidão relativa de um organismo calculando o índice competitivo ou cancelamento do índice competitivo da quantificação baseada em PCR digital da cepa de código de barras. Execute esta etapa para cada tensão de código de barras em todos os pontos de tempo. O DNA genômico contendo o código de barras AA foi diluído em um fundo de todos os outros DNA genômico com código de barras.
O Canal 1 representa a sonda FAM para o código de barras AA, enquanto o Canal 2 representa a sonda HEX para o código de barras AO. Os resultados de cada sonda são apresentados como amplitude fluorescente de gotícula individual e um histograma representando a frequência de intensidade fluorescente de todas as gotículas nos poços selecionados. Para cada condição, gotículas positivas e negativas devem formar 2 populações distintas.
As populações devem ser separadas usando o recurso limiar para definir gotículas positivas e negativas. Os valores limiares variam dependendo das sondas que foram utilizadas, mas todos os poços que utilizam a mesma mistura de sonda devem ter limiares idênticos. No caso do AA que foi diluído, o histograma parece representar apenas a população única porque gotículas positivas são substancialmente superadas por gotículas negativas.
No entanto, 2 populações distintas ainda são visíveis examinando a amplitude fluorescente de gotícula nos painéis esquerdos. Como o DNA genômico com código de barras A foi diluído, houve uma diminuição nas gotículas positivas, enquanto o número de gotículas ao positivas permanece constante. Uma vez aplicados limites apropriados a todos os poços, o software calculará o número de cópias de DNA em cada reação.
Se você realiza rotineiramente o PCR como parte de sua pesquisa, você pode executar essa técnica para avaliar a aptidão do seu organismo modelo. Este procedimento normalmente seria usado para determinar os resultados finais de experimentos a montante. Sua verdadeira utilidade é promover facilidade e versatilidade para quaisquer experimentos que dependam da quantificação bacteriana.
Estamos usando essa técnica para avaliar a salmonela fitness em um modelo murino de infecção. Além disso, esta técnica está sendo adaptada para uso com outros microrganismos patogênicos em nosso laboratório.
