Questa tecnica consente una quantificazione accurata e precisa dei microrganismi provenienti da una popolazione mista di ceppi altamente simili utilizzando tecniche molecolari rapide e ad alta produttività. In definitiva, nel consentire confronti di fitness tra ceppi. La capacità di valutare contemporaneamente molti ceppi in un unico pool riduce sostanzialmente la variabilità da pozzo a bene o da organismo a organismo perché tutti i ceppi sono esposti esattamente alle stesse condizioni.
L'adattabilità di questa tecnica consente di utilizzare quasi tutti gli organismi geneticamente malleabili e quasi tutti i progetti sperimentali che richiedono un'accurata quantificazione dei microbi. Inizia questa procedura con l'ingegneria di marcatori genetici sui cromosomi batterici, come descritto nel protocollo di testo. Crea un pool di DNA genomico che contenga ogni codice a barre tranne uno.
Utilizzare questo pool come diluente per eseguire una serie di diluizioni con DNA genomico contenente il singolo codice a barre rimanente. Preparare le reazioni per la PCR digitale in duplice copia secondo le raccomandazioni del produttore per l'utilizzo di un supermix PCR digitale progettato per la chimica basata su sonda. Usa il DNA genomico in comune come DNA modello.
Inoltre, aggiungere il master mix di sonda primer 20 X come descritto nel protocollo di testo. Preparare reazioni di controllo replicate per la PCR digitale in base alle raccomandazioni del produttore. Le reazioni di controllo per ogni combinazione di probe devono essere costituite da nessun controllo modello, controlli negativi e controlli positivi.
Ripetere questi passaggi per creare reazioni PCR digitali per ogni campione di DNA genomico codificato a barre. Genera goccioline per ogni condizione di reazione utilizzando un generatore di goccioline, secondo le istruzioni del produttore. Trasferire le goccioline appena create nell'appropriata piastra da 96 pozzi.
Utilizzare punte di pipetta da 200 microliter su una pipetta multicanale da 5 a 50 microliter. Dopo che tutte le goccioline sono state generate e trasferite, sigillare la piastra con un sigillare a piastre di lamina. Utilizzare il ciclore termico consigliato dal produttore per eseguire le condizioni di ciclo.
Durante l'esecuzione del termociclismo, programmare il software di analisi dei dati con le informazioni di configurazione della piastra, ad esempio il nome del campione, il tipo di esperimento e il Supermix utilizzato. Includere anche il nome target 1 e il tipo Target 1, nonché il nome target 2 e il tipo Target 2. Al termine della termociclina, trasferire le reazioni completate al lettore di goccioline e avviare il processo di lettura, secondo le istruzioni del produttore.
Una volta letti tutti i pozzi e completata l'esecuzione, aprire il file di dati QLP utilizzando il software di analisi dei dati. Selezionare tutti i pozzi che utilizzano la stessa sonda primer Mastermix. Nella scheda Goccioline esaminare il numero di goccioline analizzate in ogni pozzo, incluse le goccioline positive e negative.
Escludere dall'analisi qualsiasi pozzo inferiore a 10.000 goccioline totali. Passare alla scheda Ampiezza 1D ed esaminare le ampiezze delle goccioline positive e negative. Assicurarsi che comprendono 2 popolazioni distinte.
All'interno del software, utilizzare la funzione di soglia per effettuare un taglio tra goccioline positive e negative per ogni sonda utilizzata. Una volta applicate soglie appropriate a tutti i pozzi, il software calcolerà il numero di copie del DNA in ogni reazione. Esportare i dati in un foglio di calcolo per facilitare ulteriori analisi.
Utilizzando questi valori, calcolare il numero di copia iniziale di ogni codice a barre genomico univoco nel campione. Determinare il tasso medio di falsi positivi dalle reazioni di controllo negativo e sottrarre questo valore dai valori ottenuti nelle reazioni sperimentali. Moltiplicare i valori in base alle diluizioni eseguite durante l'impostazione di ogni esperimento.
Ora, determinare l'idoneità relativa di un organismo calcolando l'indice competitivo o annullando l'indice competitivo dalla quantificazione digitale basata su PCR del ceppo codificato a barre. Eseguire questo passaggio per ogni deformazione codificata a barre in tutti i punti temporali. Il DNA genomico contenente il codice a barre AA è stato diluito sullo sfondo di tutti gli altri DNA genomici codificati a barre.
Il canale 1 rappresenta la sonda FAM per il codice a barre AA, mentre channel 2 rappresenta la sonda HEX per il codice a barre AO. I risultati di ogni sonda sono presentati sia come ampiezza fluorescente a goccia individuale che come istogramma che rappresenta la frequenza di intensità fluorescente di tutte le goccioline nei pozzi selezionati. Per ogni condizione, le goccioline positive e negative dovrebbero formare 2 popolazioni distinte.
Le popolazioni devono essere separate utilizzando la funzione soglie per definire goccioline positive e negative. I valori soglia variano a seconda delle sonde utilizzate, ma tutti i pozzi che utilizzano la stessa miscela di sonde dovrebbero avere soglie identiche. Nel caso di AA che è stato diluito, l'istogramma sembra rappresentare solo la singola popolazione perché le goccioline positive sono sostanzialmente in inferiorità numerica da goccioline negative.
Tuttavia, 2 popolazioni distinte sono ancora visibili esaminando l'ampiezza fluorescente delle goccioline nei pannelli di sinistra. Poiché il DNA genomico codificato a barre AA è stato diluito, c'è stata una diminuzione delle goccioline positive, mentre il numero di goccioline AO positive rimane costante. Una volta applicate soglie appropriate a tutti i pozzi, il software calcolerà il numero di copie del DNA in ogni reazione.
Se esegui regolarmente PCR come parte della tua ricerca, puoi eseguire questa tecnica per valutare la forma fisica del tuo organismo modello. Questa procedura sarebbe normalmente utilizzata per determinare i risultati finali degli esperimenti a monte. La sua vera utilità è quella di promuovere facilità e versatilità per qualsiasi esperimento che si basi sulla quantificazione batterica.
Stiamo usando questa tecnica per valutare la forma fisica della salmonella in un modello murino di infezione. Inoltre, questa tecnica viene adattata per l'uso con altri microrganismi patogeni nel nostro laboratorio.
